細胞融合技術

細胞融合(cell fusion)或細胞雜交(cell hybridization)是指真核細胞通過介導和培養，兩個或多個細胞合并成一個雙核或多核細胞的過程。人工的細胞融合開始于20世紀50年代, 60年代到70代作為一門新興的技術, 發展非常快, 應用范圍也極為廣泛, 除了同種類細胞間可以融合, 種間遠緣細胞也能融合, 細胞與組織不同, 不排斥異類、異種細胞, 動物細胞如此，植物細胞也是如此。基因型相同的細胞融合成的雜交細胞稱為同核體(homokaryon)；來自不同基因型的雜交細胞則稱為異核體 (heterokaryon)。
目前, 誘導細胞融合的方法有三種：病毒(Okada, 1958)、聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)(Pontecorvo, 1975)和電激(Zimermann, 1980s)。副粘病毒科的病毒，如副流感病毒(Sendai virus)和新城雞瘟病毒，在其被膜中目前發現了兩種糖蛋白。較大的一種具有粘附細胞和凝血的作用；較小的一種可介導病毒同宿主細胞融合, 也可誘導細胞與細胞融合，稱為融合蛋白(fusion protein)。人工利用病毒誘導細胞融合即是利用病毒的這一特性, 使用時先用紫外線將病毒滅活, 稀釋到一定濃度加入到細胞懸液中, 誘導細胞融合。但病毒介導細胞融合方法在使用前需要病毒的繁殖與滅活，操作繁瑣，如滅活不完全則易對實驗人員造成傷害，因此現在一般不使用此方法。后兩種方法則是利用化學和物理手段，暫時使質膜脂類分子的有序排列發生改變，待去掉作用因素之后，質膜恢復原有的有序結構，在恢復過程中便有可誘導相接觸的細胞發生融合。總之，這3種方法都是在相互接觸的兩細胞進行自我修復過程中融合的。

細胞融合不僅可用于生物學的基礎理論研究，而且在生產實踐上還有重要的應用價值，如目前在單克隆抗體的制備, 核質關系, 體細胞的遺傳和發育, 新品種的培養, 免疫作用, 疾病的治療和性狀的改良, 潛伏病毒的研究等，已取得了顯著的成績。
1.實 驗 目 的

1.1. 通過PEG介導的雞血細胞融合實驗, 對體細胞融合有一個清楚的概念
1.2. 并初步掌握利用PEG介導動物細胞融合的實驗技術
2.實 驗 原 理

利用PEG介導的動物細胞融合，其實驗原理到目前為止還沒有完全定論。學者們一般認為，PEG改變各類細胞的膜結構，使兩細胞相互接觸部位的膜脂雙層中磷脂分子發生疏散、進而使其結構發生重排，再加上膜脂雙層的相互親合以及彼此間表面張力的作用，引起相臨的重排質膜在修復時相互合并在一起, 使兩細胞的胞質溝通, 從而造成相互接觸的細胞之間發生融合。
利用PEG介導細胞融合, 其融合效果受以下幾種因素的影響。1. PEG的分子量與濃度: 細胞融合效果與PEG的分子量及其濃度成正比；但PEG的分子量越大、濃度越高, 對細胞的毒性也就越大。為了兼顧二者，在實驗時常常采用的PEG分子量一般為1000~4000，濃度一般為40~60%。2. PEG的pH值: 經驗證，PEG的pH值在8.0~8.2之間融合效果最好。3. PEG的處理時間: 處理時間越長，融合效果越好, 但對細胞的毒害也就越大。故一般將處理時間限制在1分鐘之內。本實驗中細胞融合后無需繼續培養, 故處理時間可適當放寬至數分鐘。4. 融合時的溫度: 由于生物膜膜的流動性與溫度成正比，故細胞的融合效果也與溫度成正比。因此，為了獲得更好的融合效果, 在細胞可能承受的溫度范圍內可適當提高處理的溫度。對于哺乳動物的細, 一般采用的溫度為38~40℃。

本實驗所用材料為雞的血細胞，這是因為: 1. 雞血細胞具有細胞核，便于對融合細胞進行鑒別；2. 實驗材料便宜、易得。細胞融合與否，可通過觀察細胞內核的數目來進行鑒別。細胞內只有一個核，定為未融合細胞；有二至多個核，定為融合細胞。
3. 實 驗 用 品

3.1 器材
3.1.1 主要設備: 普通離心機、普通光學顯微鏡
3.1.2. 小型器材: 100ml量筒2個, 滴管10支, 10ml刻度離心管20支, 載、蓋片各20片
3.2 材料 新鮮雞血

3.3 試劑
3.3.1. Alsever液制備
葡萄糖(Glucose) 2.05g
枸椽酸鈉 0.8g
氯化鈉(NaCl) 0.42g
重蒸水 至100ml
3.3.2. 0.85%生理鹽水液
3.3.3. GKN液
氯化鈉 8g
氯化鉀(KCl) 0.4g
Na2HPO4?2H2O 1.77g
NaH2PO4?H2O 0.69g
葡萄糖 2g
酚紅(phenolred) 0.01g
溶于1000ml重蒸水中。
3.3.4. 50% PEG液 (現用現配)
根據實驗需要，稱取適量PEG(Mr.4000)放入刻度離心管內，在酒精燈上將其加熱熔化，待冷卻至50℃，加入等體積的已預熱至50℃的GKN液并充分混勻。
4.實 驗 方 法

將Alsever液與活雞翼下雞血混成1:4懸液 （抗凝效果最佳）
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4度冰箱保存
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取上述懸液加入生理鹽水混勻
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1200r/min離心5分鐘
↓棄上清
上述離心速率重復離心兩次(5min, 10min)
（以達到去除細胞表面粘附物質的目的）
↓棄上清
加入適量GKN液，配成細胞懸液
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取懸液以血球計數法計數
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再用GKN液將紅細胞的濃度稀釋
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加入 50%的PEG液混勻
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吸取 1~2滴鏡檢并計算出融合率
5.實 驗 結 果
經PEG處理后，在顯微鏡下，可觀察到未融合的單核細胞、融合后的雙核細胞和融合后的多核細胞。
細胞的融合率指在顯微鏡的視野內，已發生融合的細胞的核的總數與此視野內所有細胞的細胞核總數之比。