細胞計數實驗

實驗方法原理

顯微鏡直接計數法是將小量待測樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上（又稱計菌器），于顯微鏡下直接計數的一種簡便、快速、直觀的方法。目前國內外常用的計菌器有：血細胞計數板。Peteroff-Hauser 計菌器以及比 Hawksley 計菌器等，它們都可用于酵母、細菌、霉菌孢子等懸液的計數，基本原理相同。后兩種計菌器由于置上蓋玻片后，總容積為 0.02 mm，而且蓋玻片和載玻片之間的距離只有 0.02 mm，因此可用油浸物鏡對細菌等較小的細胞進行觀察和計數。除了用這些計菌器外，還有在顯微鏡下直接觀察涂片面積與視野面積之比的估算法。此法一般用于牛乳的細菌學檢查。

本實驗以血球計數板為例進行顯微鏡直接計數。

用血細胞計數板在顯微鏡下直接計數是一種常用的微生物計數方法。該計數板是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構成三個平臺；中間較寬的平臺又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上各刻有一個方格網，每個方格網共分為九個大方格，中間的大方格即為計數室。血細胞計數板構造如圖 VIII-1。計數室的刻度一般有兩種規格，一種是一個大方格分成 25 個中方格，而每個中方格又分成 16 個小方格（圖 VIII-2）；另一種是一個大方格分成 16 個中方格，而每個中方格又分成 25 個小方格，但無論是哪一種規格的計數板。每一個大方格中的小方格都是 400 個。每一個大方格邊長為 1 mm，則每一個大方格的面積為 1 mm2，蓋上蓋玻片后蓋玻片與載玻片之間的高度為 0.1 mm，所以計數室的容積為，0.1 mml( 萬分之一毫升）。

計數時，通常數五個中方格的總菌數，然后求得每個中方格的平均值，再乘上 25 或 16，就得出一個大方格中的總菌數。然后再換算成 1 ml 菌液中的總菌數。

設五個中方格中的總菌數為 A，菌液稀釋倍數為 B，如果是 25 個中方格的計數板，則：

1 ml 菌液中的總菌數 = A／5 × 25 × 104 × B = 50000 A ? B（個）

同理，如果是 16 個中方格的計數板，

1 ml 菌液中總菌數 = A／5 × 16 × 104 × B = 32000 A ? B（個）

實驗材料 釀酒酵母

儀器、耗材 血細胞計數板顯微鏡蓋玻片無菌毛細滴管

實驗步驟

1. 菌懸液制備

以無菌生理鹽水將釀酒酵母制成濃度適當的菌懸液。

2. 鏡檢計數室

在加樣前，先對計數板的計數室進行鏡檢。若有污物，則需清洗，吹干后才能進行計數。

3. 加樣品

將清潔干燥的血細胞計數板蓋上蓋玻片，再用無菌的毛細滴管將搖勻的釀酒酵母菌懸液。由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細滲透作用自動進入計數室，一般計數室均能充滿菌液。

4. 顯微鏡計數

加樣后靜止 5 min，然后將血細胞計數板置于顯微鏡載物臺上十先用低倍鏡找到計數室所在位置，然后換成高倍鏡進行計數。

調節顯微鏡光線的強弱適當，對于用反光鏡采光的顯微鏡還要注意光線不要偏向一邊，否則視野中不易看清楚計數宣方格線，或只見豎線或只見橫線。

5. 清洗血細胞計數板

使用完畢后，將血細胞計數板在水龍頭上用水沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹風機吹干，鏡檢，觀察每小格內是否有殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復洗滌至干凈為止。

1. 取樣時先要搖勻菌液；加樣時計數室不可有氣泡產生。

2. 在計數前若發現菌液太濃或太稀，需重新調節稀釋度后再計數。一般樣品稀釋度要求每小格內約有 5～10 個菌體為宜。每個計數室選 5 個中格（可選 4 個角和中央的一個中格）中的菌體進行計數。位于格線上的菌體一般只數上方和右邊線上的。如遇酵母出芽，芽體大小達到母細胞的一半時，即作為兩個菌體計數。計數一個樣品要從兩個計數室中計得的平均數值來計算樣品的含菌量。