細胞RNA實時成像或將“成為可能”？！

　　結合并激活熒光染料的適體熒光 RNA（FR）已用于對豐富的細胞 RNA 種類進行成像。然而，諸如低亮度和具有不同光譜特性的染料 / 適體組合的有限可用性的局限性，限制了這些工具在活的哺乳動物細胞和體內的使用。

　　2019 年 9 月 23 日，華東理工大學朱麟勇及楊弋共同通訊在 Nature Biotechnology 在線發表題為 Visualizing RNA dynamics in live cells with bright and stable fluorescent RNAs 的研究論文，該研究開發了 Peppers，一系列單體，明亮且穩定的具有熒光 RNA，其最大發射范圍從青色到紅色。Peppers 可以對活細胞中的各種 RNA 進行簡單而強大的成像，而對目標 RNA 的轉錄，定位和翻譯的干擾影響非常小。

　　定量分析單個細胞中蛋白質及其信使 RNA 的水平表明，翻譯受正常的酶動力學控制，但具有明顯的異質性。該研究進一步證明，Peppers 可用于通過 CRISPR 展示對基因組基因座進行成像，實時跟蹤蛋白質  -RNA 鏈以及進行超分辨率成像。總而言之，這些 FR 將是細胞 RNA 實時成像的有用工具。

圖片來源：Nature Biotechnology

　　RNA 在細胞中表現出復雜的動力學，包括表達，降解，易位，剪接和其他化學修飾。因此，非常需要類似于熒光蛋白標簽來理解 RNA 的動態分子生物學。感興趣的 RNA 可以通過熒光原位雜交標記，或通過標記被特定酶識別的結構基序共價標記。

　　不幸的是，這種技術需要細胞固定并且不適用于活細胞成像。具有工程化基序的 RNA 可以與熒光蛋白和特定 RNA 結合蛋白的融合物拴在一起。例如，MCP，PCP，λN 或 Cas。

Pepper530 RMFP 的特性，圖片來源：Nature Biotechnology

　　在這些方法中，由于未結合的熒光蛋白融合物自由擴散，因此存在顯著的背景熒光，并且每個 RNA 最多需要 48 個綠色熒光蛋白（GFP）融合物才能獲得最佳信噪比。這種束縛蛋白的沉重負荷是否會影響 RNA 的定位，穩定性和行為仍有待確定。

　　盡管存在這些缺陷，MS2 系統還是當前活細胞 RNA 成像的金標準，被廣泛用于研究單分子水平的 RNA 行為。更直接地，目標 RNA 可以與結合熒光團的 RNA 適體融合并可視化。

擴大 FR 的光譜范圍，圖片來源：Nature Biotechnology

　　盡管已經認識到這種概念已有好幾年了，但是許多這些熒光團和熒光團  -猝滅劑結合物在活細胞中具有顯著著的背景熒光和 / 或不易擴散跨質膜。

　　Jaffrey 和他的同事率先開發了 GFP 的 RNA 模擬物（RMFP），它們是與 GFP 熒光團的非熒光類似物特異性結合并激活其熒光的適體。在活細胞中，這些熒光團顯示出大大減少的背景熒光，突出了 RMFP 信號本身。RMFPs 已成功地用于對幾種豐富的細胞 RNA 種類進行成像，并已被開發為代謝產物和蛋白質的傳感器。

使用 Pepper 的 CRISPR 展示對基因組基因座進行多色成像，圖片來源：Nature Biotechnology

　　盡管這些 RMFP 看上去簡單而有前途，但它們具有顯著的局限性，例如相對較低的亮度，僅綠色的可用性，有限的熱穩定性或光穩定性或多聚體性質，這可能會阻礙其廣泛用于活的哺乳動物細胞和體內的一般成像應用，尤其是成像 mRNA，其豐度比核糖體 RNA 和轉移 RNA 低幾個個數量級。具有改善的細胞亮度，穩定性和最大范圍的熒光發射最大值（特別是在紅色區域）的 RMFP 仍然是理想的，但尚未實現。

　　在這里，研究人員開發了 Peppers，一系列單體，明亮且穩定的具有熒光 RNA，其最大發射范圍從青色到紅色。

　　Peppers 可以對活細胞中的各種 RNA 進行簡單而強大的成像，而對目標 RNA 的轉錄，定位和翻譯的干擾影響非常小。定量分析單個細胞中蛋白質及其信使 RNA 的水平表明，翻譯受正常的酶動力學控制，但具有明顯的異質性。該研究進一步證明，Peppers 可用于通過 CRISPR 展示對基因組基因座進行成像，實時跟蹤蛋白質  -RNA 鏈以及進行超分辨率成像。總而言之，這些 FR 將是細胞 RNA 實時成像的有用工具。