細菌中蛋白質的提取與純化技術

實驗試劑

采用T7? Tag Affinity Purification Kit

T7?Tag抗體瓊脂。B/W緩沖液：4.29mM Na2HPO4，1.47 mM KH2PO4，2.7 mM KCl， 0.137mM NaCl，1%吐溫-20，pH7.3 洗脫緩沖液: 0.1M檸檬酸，pH2.2. 中和緩沖液：2M Tris，pH10.4。 PEG 20000。

實驗步驟

1.100ml 含重組表達質粒的菌體誘導后，離心5000g×5min，棄上清，收獲菌體，用10ml預冷的B/W緩沖液重懸。

2. 重懸液于冰上超聲處理，直至樣品不再粘稠，4℃離心 14000g×30min，取上清液，0.45μm膜抽濾后作為樣品液。

3. 將結合T7?Tag抗體的瓊脂充分懸起，平衡至室溫，裝入層析柱中。

4. B/W緩沖液平衡后樣品液過柱。

5. 10ml B/W緩沖液過柱，洗去未結合蛋白。

6. 用5ml洗脫緩沖液過柱，每次1ml，洗脫液用含150μl中和緩沖液的離心管收集，混勻后置于冰上，直接SDS-PAGE分析。

7. 將洗脫下來的蛋白放入透析袋中，雙蒸水透析24hr，中間換液數次。

8. 用PEG 20000濃縮蛋白。

注意事項

蛋白在過層析柱前，要0.45μm膜抽濾，否則幾次純化后，柱子中會有不溶物。