細菌中重組蛋白的大量提取實驗

利用細菌獲得用于純化的重組蛋白是非常方便的。適用于細菌細胞蛋白提取的方法包括超聲波處理、玻璃珠研磨、釩土或石英砂研磨、French加壓罐高壓剪切細胞和溶菌酶處理。這些方法適用于從各種革蘭陰性菌和革蘭陽性菌中制備蛋白提取物。通常是使用酶的方法破壞細胞，因為細胞在懸浮液中能獲得相對均一的處理。

表達目標重組蛋白的細菌細胞

二硫蘇糖醇（DTT) DNaseI 1×Laemmli樣品緩沖液 裂解緩沖液

離心機

①4℃、3000g離心15min收集細菌。

②用裂解緩沖液洗細胞，除去殘留的培養基。重復步驟①，離心收集洗過的細胞。

③倒出上清，稱沉淀的濕重。

④每克細胞沉淀用約3ml裂解緩沖液重懸，4℃條件下攪動懸浮液30min。如果沉淀物在30min后沒有完全懸浮，用韋林攪切器低速混合懸浮液1min。

⑤加溶菌酶至終濃度1g/L，并在4℃條件下孵育35min，溫和振蕩。增加溶菌酶的濃度至10mg/ml，可以加速裂解。如此，在4℃條件下，5min就可以獲得充分的裂解

⑥按順序加人如下試劑：

NP-40至終濃度5g/L

MgCl2至終濃度5mmol/L

DNaseI至終濃度40/zg/ml

4℃攪動懸浮液30mm，除去黏性的核酸。細菌提取物包含40%?70%蛋白、10%?30%核酸、2%?10%多糖和10%?15%脂類。細胞裂解過程中DNA的釋放經常導致提取物高度黏稠，這可能在接下來的層析純化步驟中引起嚴重的麻煩。除了用DNaseI處理外，也可以加入帶正電荷的化合物，如魚精蛋白硫酸鹽(至5mg/g沉淀濕重）或聚乙稀亞胺，通過中和溶液來除去細胞提取物中的DNA(還伴有其他核酸，在一些情況下，還有高度酸化蛋白）。

實驗提示：用帶正電荷的化合物除去DNA的方法不能用于包含體的提取。因為沉淀的DNA將與包含體一起被離心下來。

⑦懸浮液在4℃條件下23000g離心30min。

⑧用含有DTT的Laemmli緩沖液重懸一小部分沉淀。

⑨利用分析級SDS-PAGE分析可溶性蛋白組分（上清）和沉淀組分，找出目的蛋白存在的位置。如果目的蛋白位于難溶的沉淀組分中，則可能是形成了包含體，那么目的蛋白就需要依照其他方案來溶解和純化。若目的蛋白位于上清中，則將其貯存于4℃，以備后續純化方案使用。

1×Laemmli樣品緩沖液：

2%SDS

10%甘油

60mmol/L Tris-Cl(pH6.8)

0.01%溴酚藍

通常把Laemmli樣品緩沖液制成2×或5×的儲液比較方便。在使用前，加DTT至終濃度100mmol/L。

裂解緩沖液：

50mmol/L Tris-Cl(pH7.4)

250g/L蔗糖

可以加人EDTA(至終濃度10mmol/L)螯合金屬離子，以降低金屬離子蛋白酶的活性。