細菌的臨床檢驗

　　臨床細菌學檢驗在檢驗醫學中具有特殊的位置，主要表現在它的高風險性（如腦脊液培養結果正確與否直接關系到患者的生死）、高干擾性（如標本采集、運送等過程中的諸多因素都會干擾檢出率和正確率）、高技術性和高嚴謹性（準確表達、報告和解釋結果直接影響治療的成敗）。因此，細菌培養和藥敏試驗等屬于高度復雜的試驗范疇。

　　由于致病菌的多樣性和變異性，臨床細菌學始終是一門知識更新和發展較快的學科。為此，從事臨床細菌檢驗的醫師和技師必須具有較好的業務素質和敬業精神，要勤于學習和探索，要有嚴謹求實的作風和對新事物的敏感性，這是高質量完成細菌檢驗任務的首要條件。

　　細菌檢驗的全面質量管理是一個連續的質量管理過程，包括從患者準備，申請單書寫，標本采集、標識、保存、運送、處理和檢驗，結果分析和報告，直至醫師的理解和應用（診治）。為了有效地對這一過程進行全面質量管理，本文從檢驗前、檢驗中和檢驗后三個方面提出相關要求。

　　檢驗前

　　（一）檢驗項目的申請

　　細菌檢驗項目的申請要有針對性和合理性。臨床醫師應在熟悉人體各部位正常菌群以及常見致病菌的基礎上，結合感染患者的癥狀、體征，科學地提出檢驗申請。對于有感染跡象者（WBC增高，中性粒細胞升高，CRP>20mg/L等），應盡快申請做細菌培養與藥敏試驗，并力爭在使用抗菌藥物之前送檢標本，以便及時獲得致病菌的有關資料和藥敏結果，正確選用抗菌藥。對于低臨床價值的細菌標本，如口腔和腸內容物、直腸周圍膿腫、褥瘡、多毛的膿腫、惡露、嘔吐物、Foley導管尖等，由于易受正常菌群的污染，細菌培養價值較低，一般不做細菌培養；必須申請細菌培養時，其結果應結合臨床分析。由于細菌檢驗的特殊性，細菌檢驗申請單必須提供臨床信息，特別應說明患者是否使用過抗菌藥以及使用過何種抗菌藥，以便于實驗室有的放矢地抵消抗菌藥的作用，提高細菌培養陽性率。

　　（二）檢驗標本的采集、保存、運送和驗收

　　1．患者的準備 主要包括兩個方面：一是做好采集部位的清潔和消毒工作，防止正常菌群的污染；二是耐心細致地交待患者，使其主動配合以便采集到有價值的標本。

　　2．標本采集 標本正確采集十分重要，其目的是千方百計捕捉病原菌并保持其活性，以提高檢出率，同時又要盡可能避免非病原菌的污染和干擾。為此，要根據各種感染性疾病和目標病原菌的不同特點，正確合理地確定采樣部位、時機和次數。要選用恰當的采樣器材并嚴格按規范操作。一般來講，采樣量多一些有利于病原菌的檢出，但應以不影響患者健康和便于操作為前提，因此采樣量要恰當。

　　3．標本保存與送檢 盛標本的容器應無菌、不漏和便于密封。要根據目標病原菌的特點決定是否使用保菌液、運送液或增菌液，以及選擇何種保菌液、運送液或增菌液。標本采集后應盡可能立即送檢。如不能及時送檢，要根據目標病原菌的特點確定保存條件（如溫度等），在規定的時間內送到實驗室。

　　4．驗收和登記 標本的驗收和登記要有專人負責。驗收的內容主要包括：采樣時間與送檢時間（注意時間間距）以及送檢條件是否符合保存致病菌活力的要求；盛標本容器是否有溢漏和污染；申請單是否填寫完整；標本標識是否與申請單一致和唯一等。對不合格的標本要拒收，并向送檢醫護人員說明拒收原因，告知正確送檢的要求，囑其重新采集和送檢標本。

　　以上各項均與細菌檢驗的質量密切相關，檢驗科（細菌室）應與臨床科室通過共同研討，認真制定有關的要求和標準操作程序，并嚴格執行。

　　檢驗中

　　（一）致病菌分離鑒定

　　1．標本（細菌）的接種、分離和鑒定

　　根據標本和檢驗目的的不同接種不同的培養基。對陽性培養要分離純化，然后進行分群和種屬鑒定。整個操作過程要按標準操作程序（SOP）進行，不得隨意更改操作程序，對于疑難菌株，要查閱文獻、組織會診，不能草率作出結論。

　　2．檢驗過程的記錄和結果報告

　　檢驗過程中所見現象和發現的問題，均應如實地記錄，以便于分析實驗結果，作出正確結論和發出可信的報告，亦可作為今后總結和改進工作的依據。所發報告內容要登記，以便查詢；如原（初步）報告有誤或不完善，應發糾正報告。

　　（二）藥敏試驗質控

　　藥敏試驗應嚴格按最新發布的NCCLS所規定的培養基、操作方法、藥敏紙片和判定標準進行。為了監控試驗過程的質量，必須做好藥敏質控。

　　1．常用的藥敏質控標準菌株

　　NCCLS從美國菌種收集中心（ATCC）選擇推薦了一些菌株作為質控標準株（見表1）。

　　2．質控株的保存

　　盡管質控標準株比其他一些菌株藥敏結果是相對穩定的，但反復多次的傳代不可避免地會造成菌株的變異。為防止變異，必須將標準株凍干保存。每月從凍干株中復蘇1次，種入大豆胰酶消化肉湯中（厭氧菌可用GAM肉湯等）作為工作株。工作株可存于4℃～8℃，并于每周轉種1次。通常工作株轉種4～5次后即須棄去。在質控中，如發現工作株結果有疑問，應予以更換。反復傳代亦易使其敏感性變異，特別是銅綠假單胞菌（ATCC 27853），將會丟失對脲基青霉素的敏感性。如無凍干條件時，可將質控株置入：①含10～15%甘油的大豆胰酶消化肉湯，或②脫纖維羊（或兔）血，或③脫脂奶，或④含50%小牛血清的肉湯，存于-20℃以下環境中（最好－60℃以下），亦可防止變異。

　　3．藥敏質控方法

　　質控株應每天隨臨床分離株一道進行藥敏試驗，質控株的藥敏結果如果在質控允許范圍內（參見最新CLSI文件），說明實驗條件符合要求，結果可信；若藥敏結果在質控允許范圍外，則實驗中可能存在差錯。由于質控允許范圍的最大值與最小值是質控株在標準條件下多次重復實驗的95%可信限，故20次連續質控結果中僅允許1次落在范圍外，但不能偏離質控允許范圍中間值[（最大值+最小值）/2]4個標準差。由于允許范圍恰好包括4個標準差，故落在允許范圍外的抑菌圈直徑一定要在離中間值一個允許范圍（中間值±1個允許范圍）之內。此外，20次或更多次藥敏結果的平均值應接近中間值。如果20次連續質控結果中≥2次或30次中有≥4次結果超出了允許范圍，則提示實驗過程中存在問題，必須查找原因加以解決。常規的藥敏質控可按下法進行：連續測定某藥對質控株的藥敏結果，每天一次，共測20或30天，取得20或30個值。⑴如果20個值中僅有一個值，或30個值中僅有三個以下的值超出允許范圍，則結果基本可信，可改每天質控一次為每周一次。此后，若某周出現一次質控值超出允許范圍，則于當天查找原因（包括用錯紙片和質控株，菌株污染，孵育條件錯誤等），經糾正明顯錯誤后重測，如結果在允許范圍內可繼續每周一次的質控；如未能找出明顯原因則需采取立即糾正措施：連續質控五天，每天一次：①若五次結果皆在允許范圍以內，則繼續每周一次的質控；②五次結果只要有一次失控，則存在系統誤差，需進行增加的糾正措施：查找到原因，然后改每周一次質控為每天一次，完成20（或30）天質控，其間失控次數若在一次（或三次）以內，則再改為每周一次。⑵如果有兩個（或四個）以上的值超過允許范圍，則繼續做每天一次的質控。⑶每當改變試劑、藥敏紙片和培養基等時，均要重新進行連續20（或30）天的質控。⑷每次失控均要查找原因，糾正后才能發出報告。

　　（三）培養基、試劑和染色的質控

　　1．培養基的質控

　　培養基的好壞直接關系到能否從標本中分離到病原菌，是否出現典型的生化反應現象等關鍵所在。我國大部分實驗室都是自行制備，注意在培養基制備過程中應嚴格控制。制備后及使用前嚴格檢查，妥善保存。標明制備日期、失效期、組成、名稱批號等。

　　培養基的質控主要包括以下四個方面：①無菌試驗，每批培養基在高壓或過濾除菌后均要抽取樣本進行培養，以證實無菌生長。②支持生長試驗，以適宜的菌株接種，經培養應生長良好。③選擇和抑制生長試驗，對選擇性培養基應至少分別選1株可生長、1株被抑制菌進行接種培養，可生長菌應生長良好，被抑制菌應不能生長。④生化反應培養基至少應分別選陽性和陰性反應菌株各1株，以證實應有的反應。常用的質控菌見表2，請正確選用。

　　2．生化反應試紙和試劑的質控

　　試紙和試劑無論是外購的還是自制的，在使用時一定要注明開啟時間和失效期。測定代謝產物的試紙或試劑，要用已知陽性和陰性的菌株進行測試，并作好測試記錄。測定代謝產物的試劑，要防止細菌的污染。

　　觸酶、氧化酶、凝固酶試劑在開瓶時以及使用中，每天至少要分別用一陽性和陰性菌測試1次。桿菌肽、Optochin、ONPG、XV紙片（條）在開瓶時以及使用中，每周至少要分別用一陽性和陰性菌測試1次（XV紙片僅做陽性菌）。用于分枝桿菌鑒定的試劑在開瓶或配制時，以及每次使用時，均要做陽性菌對照（鐵的攝取試驗還要做陰性對照）。抗血清在開瓶時和使用中每月需分別用陽性反應和陰性反應菌做1次測試。抗原檢測試劑和DNA探針在每次操作時，均要設陰、陽性對照。其他試劑和紙片僅在開瓶或配制時，做1次陰、陽性反應測試即可。各種常用試紙和試劑的質控菌和預期結果見表3。

　　3．染色的質控 常用染色的質控要求見表4

　　，質控結果應作好記錄。

　　（四）儀器設備質量監測

　　實驗室內的各種儀器設備的運行情況，應每天進行監測，每一儀器均要有專人按使用說明書要求進行維護保養，儀器上要附有運行記錄卡，每天由維護保養人記錄溫度等指標的變化情況。一旦發現異常或失控，應立即查找原因并進行維修。

　　（五）積極參加室間質評

　　要按規定參加細菌學的室間質評，對實驗室質控水平進行全面評估，不斷提高檢測水平。

　　檢驗后

　　檢驗工作完成后，要綜合檢驗結果，正確及時地發出報告。陽性結果應先通知醫師，以爭取時間搶救患者。對于可疑的陰性結果或與臨床不符的結果，要與醫師共同探討，找出可能的原因，不斷提高診斷水平。對于所分離的特殊菌株，最好設法保存，以利于今后的研究工作。經常征求醫護人員和患者的意見，加強相互間的溝通，重視醫師和患者的投訴和抱怨，定期對質量管理工作進行評價，作出書面總結。要求全體檢驗人員都知道存在的問題和克服的辦法，不斷調整和改進質量管理體系。