細菌人工染色體（bacterial artificial chromosome, RAC ) 是以大腸桿菌致育因子 (fertility, F)為基礎的合成載體。本實驗來源「分子克隆實驗指南第三版」黃培堂等譯。
| 實驗方法原理 | 細菌人工染色體（bacterial artificial chromosome, RAC ) 是以大腸桿菌致育因子 (fertility, F)為基礎的合成載體。 |
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| 實驗材料 | 限制性內切核酸酶大腸桿菌培養物電轉感受態大腸桿菌細胞 |
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| 試劑、試劑盒 | LB 冷凍緩沖液 |
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| 儀器、耗材 | 脈沖場凝膠電泳儀LB 瓊脂平板LB 培養基電穿孔儀 |
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| 實驗步驟 | 一、材料
1. 緩沖液與溶液
LB 冷凍緩沖液
2. 酶與緩沖液
限制性內切核酸酶
3. 凝膠
脈沖場凝膠電泳儀
4. 培養基
含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 瓊脂平板
含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 培養基
5. 專用設備
電穿孔儀
6. 載體與菌株
BAC DNA 或 BAC 分離物轉化的大腸桿菌培養物
冷凍的電轉感受態大腸桿菌細胞
二、方法
1. 制備新鮮的 BAC 轉化子。
(1) 如果 BAC 是以 DNA 的形式提供的
① 用電穿孔法將 BAC DNA 導入大腸桿菌（DH10B 菌株）中。
② 從每批電穿孔后的菌液分別取出 2.5、25 和 250 μl，涂布于含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 瓊脂平板上。37℃ 溫育平板 16~24 h。
(2) 如果 BAC 是以轉化菌液的形式提供的
① 立即在含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 瓊脂平板上劃線培養。
② 37℃ 溫育 12~16 h。
2. 挑選 12 個轉化菌落，分別加入 5 ml 含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 培養基中。37℃ 劇烈振搖過夜。
3. 在每 12 管 5 ml 培養液中各取 1 菌環，分別接種于 LB 冷凍培養基中培養。待細菌生長后，轉移至 -20℃ 冷凍保存。
4. 從步驟 2 每個 5 ml 菌液中取 4.5 ml，純化 BAC DNA。
5. 分析 BAC DNA
(1) 用 PCR 法或用 SouAem 雜交鑒定 BAC 含有染色體的目的區域。
(2) 用限制酶切和 PFGE 檢測插入片段的大小。
6. 根據檢測結果，選一個或多個 BAC 作進一步分析。 |
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