細菌人工染色體的應用

限制性內切核酸酶 大腸桿菌培養物 電轉感受態大腸桿菌細胞

LB 冷凍緩沖液

脈沖場凝膠電泳儀 LB 瓊脂平板 LB 培養基 電穿孔儀

一、材料

1. 緩沖液與溶液

LB 冷凍緩沖液

2. 酶與緩沖液

限制性內切核酸酶

3. 凝膠

脈沖場凝膠電泳儀

4. 培養基

含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 瓊脂平板

含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 培養基

5. 專用設備

電穿孔儀

6. 載體與菌株

BAC DNA 或 BAC 分離物轉化的大腸桿菌培養物

冷凍的電轉感受態大腸桿菌細胞

二、方法

1. 制備新鮮的 BAC 轉化子。

(1) 如果 BAC 是以 DNA 的形式提供的

① 用電穿孔法將 BAC DNA 導入大腸桿菌（DH10B 菌株）中。

② 從每批電穿孔后的菌液分別取出 2.5、25 和 250 μl，涂布于含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 瓊脂平板上。37℃ 溫育平板 16~24 h。

(2) 如果 BAC 是以轉化菌液的形式提供的

① 立即在含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 瓊脂平板上劃線培養。

② 37℃ 溫育 12~16 h。

2. 挑選 12 個轉化菌落，分別加入 5 ml 含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 培養基中。37℃ 劇烈振搖過夜。

3. 在每 12 管 5 ml 培養液中各取 1 菌環，分別接種于 LB 冷凍培養基中培養。待細菌生長后，轉移至 -20℃ 冷凍保存。

4. 從步驟 2 每個 5 ml 菌液中取 4.5 ml，純化 BAC DNA。

5. 分析 BAC DNA

(1) 用 PCR 法或用 SouAem 雜交鑒定 BAC 含有染色體的目的區域。

(2) 用限制酶切和 PFGE 檢測插入片段的大小。

6. 根據檢測結果，選一個或多個 BAC 作進一步分析。