細菌內毒素中什么是定量法

目前,國內外廣泛應用且檢測技術比較成熟的細菌內毒素定量檢查法主要有以下四種。
1. 1　凝膠法　是目前最常用的細菌內毒素檢查法。即在10mm×75mm的小試管內,加入待檢樣品和鱟試劑各0. 1ml混合, 37℃、60 min保溫反應后, 180°倒轉,根據凝膠形成的情況(凝膠是否堅實)作為判定指標的一種半定量法。此法操作簡單,經濟而且不需要專用儀器。凝膠法既可限量檢測內毒素,也可在0. 03 EU?ml-1以上進行半定量測定。
1. 2　顯色基質法(合成基質法、顯色合成基質法, Chromoge-nic Technique)　系根據細菌內毒素與LAL(或TAL)試劑中的C系反應所激活的凝固酶,使用人工合成的鱟三肽(即與PNA相連的顯色基質如BOC-LEU-GLY-ARG-PNA等)作為顯色基質,水解鱟三肽中的精氨酸肽鏈,通過測量反應液中釋放出游離的對硝基苯胺(PNA)的吸光值而進行定量的一種檢測方法。該法需要專用儀器。目前主要用于微量血漿、血清、全血、骨髓液及尿、乳汁等的臨床檢驗以及家禽、實驗動物、人工臟器的安全性評估等方面。根據測定原理的不同分為終點顯色法和動態顯色法。
1.2.1　終點顯色法(EndopointColorimetric Assay)　系根據在一定時間內游離出的PNA的量與細菌內毒素濃度成正比例關系進行測定的一種分析方法。PNA(黃色)的吸光度值可使用單波長405 nm或雙波長(測定波長405 nm、參照波長492 nm)測量,或利用游離的PNA與紅色偶氮試劑發生反應所形成的紅色偶氮藍復合物在545nm單波長或雙波長(測定波長545 nm、參照波長630 nm)進行檢測。一般可在0. 006~15 EU/ml范圍內進行定量。
1.2.2　動態顯色法(Kinetic Colorimetric Assay)　系根據游離的PNA的吸光度變化率(mAbs/min)與細菌內毒素濃度成正比例關系(比色反應速度法Pate Assay)或到達事先設定的反應吸光度變化值所需要的時間Ta的對數值與細菌內毒素濃度的對數值成反比例關系(比色反應時間法OD-Time As-say)進行測定的一種分析方法。一般可在0. 006~50 EU/ml范圍內進行定量。
1. 3　酶聯免疫測定法(ELISA法)　基于抗原抗體的酶聯免疫測定法,目前在國外應用十分普遍。主要由外加熱原質刺激巨嗜細胞后產生的內熱原物質(如TNF, TL-1等),而進行的定量測定方法。體外人全血熱原檢測方法是近年來國內外正在興起的一種研究熱原檢測的新方法,具有檢測范圍廣,靈敏度高,不同個體血液的結果差異小等優點[2, 3]。國內一些學者,已采用酶聯免疫測定法對體外人全血熱原檢測方法的可行性進行研究和優化,取得了可喜的進展[4]。1. 4　濁度法(Turbidim etrc Technique)　系微量的內毒素與TAL(LAL)試劑中的C因子發生反應,由內毒素引發激活的凝固酶,切斷凝固蛋白特定位置的精氨酸肽鍵,形成凝固蛋白從而產生凝膠過程中的濁度變化,采用適當的光學儀器測量的一種分析方法。此法操作比較簡單、經濟、靈敏度高,檢測范圍廣。通常在0. 006~300 EU/ml的范圍內進行定量,但需要專用儀器。根據測定原理的不同又可分為終點濁度法和動態濁度法。
1.4.1　終點濁度法(EndopintTurbidimetric Technique)　即根據到達規定點上反應液的最終濁度值(吸光度或透過光亮值)與細菌內毒素濃度成正比例或反比例的關系而進行測量的一種檢測方法。由于未形成標準化,目前國內外都很少使用,也未見有專門儀器使用。
1.4.2　動態濁度法(Kinetic Turbidimetric Technique)　即根據測定到達事先設定反應液的濁度變化(吸光度變化)值所需要的時間(Ta比濁反應法)或濁度變化(透過光量比)值所需要的時間(Tg:比濁時間分析法)的對數值與細菌內毒素濃度的對數值成反比例關系或濁度的(吸光度值)每分鐘變化(吸光度變化mAbs/min)與細菌內毒素濃度成正比例關系(比濁反應速度法)而進行測量的一種分析方法。通常,濁度法一般是指動態濁度法,而且在日、美、歐等國有專用儀器,并通過美國FDA認可,其中作為動態比濁儀一般要求為:恒溫槽(37±1℃)、光源、檢測器及內置數據分析等。其中檢測波長從80~660 nm,主要根據儀器的不同而各異,檢測時間為60~90 min之間。由于國內對細菌內毒素定量檢查法的研究起步較晚,專門用于定量的高靈敏度TAL(最低檢測限是0. 006EU/ml)還未研制開發出來,還受細菌內毒素檢查用水(內毒素的含量小于0. 005 EU/ml)、內毒素標準品質量不高等因素的制約,對儀器定量法研究較多且檢測技術較為成熟的就是動態濁度法。本法收載于2000年版《中國藥典》二部附錄中,在2005年版《中國藥典》二部附錄中,將濁度法和顯色基質法修訂為光度測定法,作為測定內毒素含量的方法。