細菌的分離與培養

實驗目的：

掌握在各種培養基上的接種方法并觀察生長現象。

實驗材料：

菌種、普通瓊脂  平板、肉湯培養基、半固體培養基、斜面培養基、接種環、接種針、酒精燈。

實驗內容：

一、平板劃線接種法（分離培養法）

原理：通過在平板上劃線，將混雜的細菌  在瓊脂平板表面充分的分散開，使單個細菌能固定在一點上生長繁殖，形成單個菌落，以達到分離純種的目的。若需從平板上獲取純種，則挑取一個單個菌落作純培養。

用途： 分離出純種細菌，以利作純培養。

操作方法（三區劃線法）：

1、右手拿接種環，燒灼冷卻后，取菌液一環。

2、左手抓握瓊脂平板（讓皿蓋留于桌上），在酒精燈火焰左前上方，使平板面向火焰，以免空中雜菌落入，右手將已沾菌的接種環在瓊脂表面密集而不重疊的來回劃線，面積約占整個平板的1/5-1/6，此為第一區。劃線時接種環與瓊脂呈30-40度角輕輕接觸，利用腕力滑動，切忌劃破瓊脂。

3、接種環上多余的細菌可燒灼（每劃完一個區域是否需要燒灼滅菌視標本中含菌量多少而定），待冷后，在劃線末端重復2-3根線后，再劃下一區域（約占1/4面積），此為第二區。

4、第二區劃完后可不燒灼接種環，用同樣方法劃第三區，劃滿整個平皿。

5、劃線完畢，將平板扣入皿蓋并作好標記，置37℃溫箱孵育18-24小時觀察瓊脂表面菌落分布情況，注意是否分離出單個菌落，并記錄菌落特征（如大小、形狀、透明度、色素等）。

二、液體培養基接種法

用途：凡肉湯、蛋白胨水，各種單糖發酵均用此法接種。可以觀察細菌不同的生長性狀、生化特性以供鑒別之用。

操作方法：

右手執筆式握住接種環，滅菌冷卻后取單個菌落。

1、 左手拇指、食指、中指托住液體培養基之下端，右手小指和無名指（或手掌）拔取試管塞，將管口移至火焰上旋轉燒灼。

2、 將沾菌的接種環移入培養基管中，在液體偏少側接近液面的管壁上輕輕研磨，沾取少許液體與之調和，使菌液混合于培養基中。

3、 管口通過火焰，塞好試管塞，將接種環滅菌后放下，經37℃溫箱孵育18-24小時，取出觀察生長情況。

三、半固體穿刺接種法

用途：觀察細菌動力，保存菌種。

方法：

1、以無菌操作用接種針挑取單個菌落，立即垂直插入培養基中心至接近管底處循原路退回。

2、管口通過火焰，塞上棉塞，接種針滅菌后放下。試管置37℃溫箱孵育18-24小時，取出后對光觀察穿刺線上細菌生長情況：細菌有無向周圍擴散生長，穿刺線是否清晰等。

四、斜面培養基接種法

用途：常用于擴大純種細菌及實驗室保存菌種。

操作方法：

1、 以無菌操作法用接種環挑取單個菌落，自斜面底向上劃一直線，然后再從底向上輕輕來回作蜿蜒劃線。

2、 管口通過火焰，塞上棉塞，接種環燒灼后方可放下。置37℃溫箱孵育18-24小時，取出觀察斜面上菌苔生長情況。