細菌
由于各種菌對藥物的敏感性不同，產生的抑菌環大小不同，如果菌種不純，試驗中所產生的抑菌環大小與該菌種在純培養狀態下產生的抑菌環大小存在較大的差異，影響判斷結果的準確性。因此需要對各種致病菌提純后，分別進行不同的藥敏試驗。藥敏試驗時，需要將提純后的菌種配制成一定濃度的菌液。WHO組織制定的標準是要求菌液濃度在1．5億/ml 左右。若菌液濃度過高，該菌會對所有藥物產生耐藥；反之，菌液濃度過低，該菌會對所有藥物均敏感。最精確的方法是使用分光光度計測定新鮮培養物菌懸液的吸光度，來確定菌液濃度。國家細菌耐藥性監測網的三級甲等醫院，其微生物實驗室大多數用此法來確定藥敏試驗的菌液濃度。
藥敏試驗中要將菌液均勻地涂在培養基上，使細菌均勻分布，這樣才能使試驗結果不會出現較大的偏差。涂菌后15min才能貼藥敏紙片。由于涂菌后，細菌要有一段時間的適應過程，但是時間不能過長，否則會使細菌產生耐藥。貼藥敏紙片時，每取一種藥敏紙片必須燒一下鑷子口，避免藥敏紙片之間相互混淆，以提高藥敏的準確性。藥物殺滅細菌存在一定的量比，藥敏試驗培養基上細菌層越厚抑菌圈就越小，反之抑菌圈就越大。根據一種藥物抑菌圈的有無或者大小，只能判斷出該藥對細菌有沒有效果，但其敏感性的高低需要通過科學嚴謹的實驗來確定。藥物的敏感程度需要根據藥敏試驗的結果，并結合以上因素做綜合分析，才能得出科學的結論，而片面地根據藥敏圈的大小來決定敏感與否，結果不夠準確。
培養時間
一般培養溫度和時間為37℃ 8-18小時，有些抗菌藥擴散慢如多粘菌素，可將已放好抗菌藥的平板培養基，先置4℃冰箱內2~4小時，使抗菌藥預擴散，然后再放37℃溫箱中培養，可以推遲細菌的生長，而得到較大的抑菌圈。