1. 第一次使用時，在Buffer W2 中按試劑瓶上指定的體積加入無水乙醇并混合均勻。
2. 準備Buffer DV：取2 ml Buffer DV-A，125 ml 異丙醇，75 ml 異丁醇，加入提供的250 ml 試劑瓶中，混合均勻。
3. 4℃預冷Buffer DV。
4. 第一次使用試劑盒時，用50%甘油溶解溶菌酶，使溶菌酶濃度為50 mg/ml。
5. 第一次使用試劑盒時將隨試劑盒攜帶的RNase A 全部加入Buffer S 中，混合均勻。
6. 準備65℃水浴。
7. 檢查Buffer G-A 和Buffer G-B 是否出現沉淀，若出現沉淀，于65℃水浴加熱至沉淀完全溶解后再使用。
8. 將Eluent 或去離子水加熱至65℃有利于基因組DNA 的充分洗脫。
三、操作步驟
1. 用2 ml 離心管收集1.0x109（1 ml 菌液OD600 為1-1.5）的細菌培養物，12 000xg 離心30 s，棄盡上清。用150 ul 已加入RNase A 的Buffer S 懸浮沉淀。
* 確認RNase A 已加入Buffer S 中。 * 懸浮需均勻，不應留有小的菌塊，否則將影響溶菌效果。
2. 加入20 ul 溶菌酶貯存液，混合均勻，室溫靜置5 min。
3. 加入30 ul 0.25 M EDTA（pH 8.0），混合均勻，冰浴5 min。
4. 加入450 ul Buffer G-A,旋渦振蕩15 s，65℃水浴10 min。
5. 加入400 ul Buffer G-B 和1 ml Buffer DV（4℃預冷），用力混合，12 000xg 離心2 min。
* 請在實驗前按照實驗準備步驟2 內容，準備Buffer DV。
6. 盡可能丟棄上相，保留相間沉淀和下相。加入1 ml 4℃預冷Buffer DV，用力混合，12 000xg 離心2 min。
7. 丟棄上相，將下相轉移至濾器（濾器置于2 ml 離心管中）。12 000xg 離心1 min。
* 上相無需完全棄盡，在轉移無色下相時偶有混入的上相，可在Tip 頭內迅速分相，便于丟棄。 * 如在轉移過程中吸入少量界面沉淀，不必去除，可過濾除去。 * 有色上相務必除盡，否則將抑制DNA 結合到silica 膜上。
8. 棄濾器，在濾液中加入400 ul Buffer BV，混合均勻。
步驟9-12 可選擇離心法或負壓法
A. 負壓法
9A. 將制備管插到負壓裝置的插口上，將步驟8 中的混合液移入制備管中，開啟并調節負壓至-20-30 英寸汞柱，吸盡管中溶液。
10A. 保持負壓，加入500 ul Buffer W1，吸盡管中溶液。
11A. 保持負壓，沿管壁四周加入700 ul Buffer W2，吸盡管中溶液；以同樣的方法再用700 ul BufferW2 洗滌一次。
* 確認在Buffer W2 concentrate 中已按試劑瓶上指定的體積加入無水乙醇。
* 沿管壁四周加入Buffer W2 有助于徹底沖洗沾附在管壁上的鹽份。
* 兩次用Buffer W2 沖洗能確保鹽份被完全清除，消除對酶切反應的影響。
12A. 將制備管置于一個2 ml 離心管中，12 000xg 離心1 min。
B. 離心法
9B. 將制備管置于2 ml 離心管中，將步驟8 中的混合液移入制備管中，12,000xg 離心1 min。
10B. 棄濾液，將制備管置回到原2 ml 離心管中，加入500 ul Buffer W1，12 000xg 離心1 min。
11B. 棄濾液，將制備管置回到原2 ml 離心管中，加入700 ul Buffer W2，12 000xg 離心1 min。
以同樣的方法再用700 ul Buffer W2 洗滌一次。
* 確認在Buffer W2 concentrate 中已按試劑瓶上指定的體積加入無水乙醇。
* 兩次用Buffer W2 沖洗能確保鹽份被完全清除，消除對酶切反應的影響。
12B．棄濾液，將制備管置回到原2 ml 離心管中，12 000xg 離心1 min。
13. 將制備管置于另一潔凈的1.5 ml 離心管中，在silica 膜中央加100-200 ul Eluent 或去離子水，室溫靜置1 min。12 000xg 離心1 min 洗脫DNA。
* 將去離子水或Eluent 加熱至65℃將提高洗脫效率。 收起 | 