細菌基因組DNA提取實驗

實驗方法原理 本試劑盒采用獨特的細胞裂解和相分離技術，結合DNA 制備膜選擇性地吸附DNA 的方法達到純化基因組DNA 的目的。適合于從1.0×109 細菌中獲得多至20 μg 的基因組DNA。用于PCR、Southern 印跡分析、RAPD、RFLD 等分子生物學實驗。

實驗材料 細菌培養物

試劑、試劑盒 細菌基因組DNA試劑盒

儀器、耗材 DNA 制備管小量濾器離心管

實驗步驟

一、試劑盒組成、貯存、穩定性

1.  說明書，耗材：DNA 制備管，小量濾器，2 ml 離心管，1.5 ml 離心管。

2.  RNase A：50 mg/ml，室溫保存。

3.  溶菌酶：50%甘油溶解溶菌酶，使溶菌酶濃度為50 mg/ml，-20℃密閉貯存。

4.  Buffer S：細菌原生質制備液，加入RNase A 后，4℃密閉貯存。

5.  0.25M EDTA：室溫密閉貯存。

6.  Buffer G-A：裂解液，室溫密閉貯存。

7.  Buffer G-B：蛋白去除液，室溫密閉貯存。

8.  Buffer DV-A：Buffer DV 的制備液，請參照實驗準備Buffer DV 的配制方法配制，室溫密閉貯存。

9.  Buffer DV：相分離液，室溫密閉貯存。

10.  Buffer BV：DNA 結合液，室溫密閉貯存。

11.  Buffer W1：洗滌液，室溫密閉貯存。

12.  Buffer W2 concentrate：去鹽液。使用前按試劑瓶上指定的體積加入無水乙醇并混合均勻，室溫密閉貯存。可用100%乙醇或95%乙醇。

13.  Eluent ：2.5 mM Tris-HCl，pH 8.5，室溫密閉貯存。

二、實驗準備

1. 第一次使用時，在Buffer W2 中按試劑瓶上指定的體積加入無水乙醇并混合均勻。

2. 準備Buffer DV：取2 ml Buffer DV-A，125 ml 異丙醇，75 ml 異丁醇，加入提供的250 ml 試劑瓶中，混合均勻。

3. 4℃預冷Buffer DV。

4. 第一次使用試劑盒時，用50%甘油溶解溶菌酶，使溶菌酶濃度為50 mg/ml。

5. 第一次使用試劑盒時將隨試劑盒攜帶的RNase A 全部加入Buffer S 中，混合均勻。

6. 準備65℃水浴。

7. 檢查Buffer G-A 和Buffer G-B 是否出現沉淀，若出現沉淀，于65℃水浴加熱至沉淀完全溶解后再使用。

8. 將Eluent 或去離子水加熱至65℃有利于基因組DNA 的充分洗脫。

三、操作步驟

1. 用2 ml 離心管收集1.0×109（1 ml 菌液OD600 為1-1.5）的細菌培養物，12 000×g 離心30 s，棄盡上清。用150 μl 已加入RNase A 的Buffer S 懸浮沉淀。

* 確認RNase A 已加入Buffer S 中。

* 懸浮需均勻，不應留有小的菌塊，否則將影響溶菌效果。

2. 加入20 μl 溶菌酶貯存液，混合均勻，室溫靜置5 min。

3. 加入30 μl 0.25 M EDTA（pH 8.0），混合均勻，冰浴5 min。

4. 加入450 μl Buffer G-A,旋渦振蕩15 s，65℃水浴10 min。

5. 加入400 μl Buffer G-B 和1 ml Buffer DV（4℃預冷），用力混合，12 000×g 離心2 min。

* 請在實驗前按照實驗準備步驟2 內容，準備Buffer DV。

6. 盡可能丟棄上相，保留相間沉淀和下相。加入1 ml 4℃預冷Buffer DV，用力混合，12 000×g 離心2 min。

7. 丟棄上相，將下相轉移至濾器（濾器置于2 ml 離心管中）。12 000×g 離心1 min。

* 上相無需完全棄盡，在轉移無色下相時偶有混入的上相，可在Tip 頭內迅速分相，便于丟棄。

* 如在轉移過程中吸入少量界面沉淀，不必去除，可過濾除去。

* 有色上相務必除盡，否則將抑制DNA 結合到silica 膜上。

8. 棄濾器，在濾液中加入400 μl Buffer BV，混合均勻。

步驟9-12 可選擇離心法或負壓法

A. 負壓法

9A. 將制備管插到負壓裝置的插口上，將步驟8 中的混合液移入制備管中，開啟并調節負壓至-20-30 英寸汞柱，吸盡管中溶液。

10A. 保持負壓，加入500 μl Buffer W1，吸盡管中溶液。

11A. 保持負壓，沿管壁四周加入700 μl Buffer W2，吸盡管中溶液；以同樣的方法再用700 μl BufferW2 洗滌一次。

* 確認在Buffer W2 concentrate 中已按試劑瓶上指定的體積加入無水乙醇。

* 沿管壁四周加入Buffer W2 有助于徹底沖洗沾附在管壁上的鹽份。

* 兩次用Buffer W2 沖洗能確保鹽份被完全清除，消除對酶切反應的影響。

12A. 將制備管置于一個2 ml 離心管中，12 000×g 離心1 min。

B. 離心法

9B.  將制備管置于2 ml 離心管中，將步驟8 中的混合液移入制備管中，12,000×g 離心1 min。

10B.  棄濾液，將制備管置回到原2 ml 離心管中，加入500 μl Buffer W1，12 000×g 離心1 min。

11B.  棄濾液，將制備管置回到原2 ml 離心管中，加入700 μl Buffer W2，12 000×g 離心1 min。

以同樣的方法再用700 μl Buffer W2 洗滌一次。

* 確認在Buffer W2 concentrate 中已按試劑瓶上指定的體積加入無水乙醇。

* 兩次用Buffer W2 沖洗能確保鹽份被完全清除，消除對酶切反應的影響。

12B．棄濾液，將制備管置回到原2 ml 離心管中，12 000×g 離心1 min。

13. 將制備管置于另一潔凈的1.5 ml 離心管中，在silica 膜中央加100-200 μl Eluent 或去離子水，室溫靜置1 min。12 000×g 離心1 min 洗脫DNA。

* 將去離子水或Eluent 加熱至65℃將提高洗脫效率。

注意事項

1.  Buffer G-B、Buffer BV 和Buffer W1 含刺激性化合物，操作時要戴乳膠手套和眼鏡，避免沾染皮膚、眼睛和衣服、謹防吸入口鼻。若沾染皮膚、眼睛時，要立即用大量水或生理鹽水沖洗，必要時尋求醫療咨詢。