一、方法
1. 按涂片→干燥→固定→染色→鏡檢的順序進行。準備載物玻片：用鑷子從載物片缸中取出經3％鹽酸酒精脫脂的載物玻片，用擦片布擦凈，然后用特種鉛筆在玻片背面畫一個直徑為1.5~2.0cm的圓圈，做為涂膜的標記范圍。
2. 點燃煤氣燈：先把煤氣燈的煤氣孔和通氣孔閉上，再把管道的煤氣開關打開，然后把煤氣燈的煤氣口稍稍開放，立即用火柴點燃之，適當調節煤氣孔和通氣孔，使火焰長度在8~10cm，并能分清內外焰為止。
二、步驟
1. 涂片：按無菌操作取材法進行，具體步驟如下：
用肉湯培養物涂片：
（1）右手拿接種環的黑色塑料柄部分，左手托持試管。
（2）將接種環按15°角放在煤氣燈的外焰中燒灼滅菌，直到把金屬絲燒紅(圖1-2)，然后將鋁制的銀色柄部也通過火焰略加燒灼。
（3） 用右手小指和手掌的前內緣拔掉左手所持試管的棉塞，并立即將試管口用火焰燒灼滅菌。
（4） 用滅菌后已冷卻的接種環伸入試管中取出材料(圖1-3)，此時注意勿使沾有材料的接種環觸碰試管壁及試管口。
（5） 將試管口再次滅菌，棉塞也要在火焰上略加燒灼（時間要短以免點燃棉塞），塞好棉塞，放回原處。
（6） 將接種環上之材料涂于載物片上，隨后立即將接種環用火焰燒灼滅菌。為防止細菌濺散污染環境，接種環滅菌前，須先將接種環靠近火焰或放內焰中烤干，然后再在外焰中燒紅滅菌，殺死殘留的細菌。
用斜面培養物涂片：
用細菌斜面培養物涂片，需預先取一接種環生理鹽水放在載物片上，然后再按無菌操作取材法從斜面培養物上取少量菌苔，在水滴內輕輕研磨將細菌制成菌懸液，再涂成一薄膜。無菌操作取材步驟同前。
2. 干燥
放空氣中自然干燥。如欲加速，也可把涂片置于火焰上部的熱氣層中烘烤，但切勿將涂膜烤焦。
3. 固定
用染色夾子夾住涂片，在火焰的最熱部分連續通過三次，以固定之。此時殺死大部分細菌，并使標本固定于玻片上，以免在染色或水洗過程中被沖掉。
4. 染色
①將結晶紫染液加于涂膜上，染色（初染）1 min。
②水洗后加蘆戈氏碘液處理(媒染)1 min。
③水洗后用95%酒精脫色，脫色時頻頻搖動玻片，直至流下的液體無色為止(約需0.5 min)。
④水洗后加石炭酸復紅稀釋液染色(復染)0.5 min。
⑤水洗，用濾紙輕輕吸干，待標本充分干燥后進行鏡檢。
染色過程中，水洗要用自來水的細流徐徐沖洗，沖洗涂膜的背面，勿使強水流直接沖到涂膜上。
三、結果觀察
使用油鏡觀察，注意標本中兩種細菌的形態、大小、排列各如何，最后判定染色性，哪種細菌是革蘭氏陽性菌(染成紫色)，哪種細菌是革蘭氏陰性菌(染成紅色)。
將在標本中觀察到的細菌形態和染色性，用有色鉛筆畫出模式圖，并附以文字說明。
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