細菌的染色及形態觀察

一、目的要求
1、了解細菌染色的基本原理。
2、掌握細菌的簡單染、革蘭氏染色及其他染色方法。
3、觀察和識別細菌的形態及細菌細胞的特殊結構。
二、實驗說明
細菌菌體微小、而且折光率低，在顯微鏡下特別是在油浸物鏡下幾乎與背景無反差，很難看清楚，如將其染色，使折光率增大，便容易觀察。由于菌體的性質及各部分對某些染料的著色性不同，因此可以利用不同的染色方法來區別不同的細菌及其結構。
用于細菌染色的染色劑是苯環上含有發色基團和助色基團的化合物。發色基團使化合物本身具有染色之能力，助色基團有電離特性，可以于被染物結合，使被染物著色。

染色劑有三種：酸性染色劑（電離后分子帶負電荷）；堿性染色劑（電離后分子帶電荷）；復合染色劑（在電離后分子不帶電荷，故也稱為中性染色劑）。酸性染色劑主要用于染細胞質；堿性染色劑主要用于染核和異染顆粒等細胞結構；復合染色劑主要用來染螺旋體和立克次氏體。
三、實驗材料
1、顯微鏡、香柏油、二甲苯、擦鏡紙。
2、酒精燈、接種環、載玻片。
3、石炭酸復紅染色液、革蘭氏染色液、莢膜染色液、鞭毛染色液（配方見附錄）。
四、方法步驟
（一）簡單染色法
步驟：涂片 → 干燥 → 固定 → 染色 → 水洗 → 干燥
鏡檢。
1、涂片 在干凈的載玻片中央加一滴蒸餾水，以無菌操作法，從斜面上挑取少量菌種，在載玻片上和水混合后，涂成一均勻薄層。
2、干燥固定 涂片讓其在空氣中自然干燥，有時為使其干燥得快點，也可在酒精燈上加溫，但勿賢緊靠火焰。
3、固定 待涂片干燥徨，手持載玻片一端，有菌膜的一面向上，在酒精燈火焰上通過幾次（用手背觸載玻片背面，以不燙手為宜），待冷卻后，再加染料。
4、染色 玻片置于水平位置。加石炭酸復紅液于菌膜部位。染1-2min。
5、水洗 傾去染液，斜置玻片，用很細水流的自來水沖洗（切勿使水流直接沖刷在菌膜處），直至洗下水呈無色為止。
6、干燥 自然干燥或用吸水紙吸干。
7、鏡檢。
（二）革蘭氏染色法
步驟：涂片 → 干燥 → 固定 → 結晶紫染色 → 水洗 → 吸干 → 95%酒精脫色 → 水洗 → 吸干 → 蕃紅復染 → 水洗 → 干燥 → 鏡檢。
1、涂片 同簡單染色法
2、干燥 同簡單染色法。
3、固定 同簡單染色法。
4、用草酸結晶紫染色1min后水洗。
5、加碘液媒染1min。
6、水洗。
7、用95%酒精脫色，直至流下的酒精不呈紫色即停止（大約半分鐘）立即水洗。
８、復染　　滴加蕃紅染液復染1min。
９、水洗。
10、干燥。
11、鏡檢。
（三）特殊染色法
1、芽孢染色法 芽孢壁較厚，透性低，著色和脫色均較困難，因此，芽孢染色需加熱，并用著色力強的染料。
步驟：涂片 → 固定 → 孔雀綠染色 → 水洗 → 干燥 → 觀察。
1、涂片 取一載片，將枯草桿菌以無菌操作涂片。
2、干燥 同簡單染色法。
3、固定 同簡單染色法。
4、加孔雀綠染液于涂片上，在火焰上加熱直至有蒸氣時開始計算時間，維持3-5min。加熱時要隨時添加染色液，切片讓標本干涸。
5、水洗 待玻片冷卻后，用自來水水洗。
6、復染 加蕃紅液復染1-2min。
7、水洗 干燥。
8、鏡檢。
結果：芽孢呈綠色，芽孢周圍的菌體呈紅色。
2、莢膜染色法（用固氮菌或肺炎雙球菌）
步驟：
1、在載片一端滴一滴自來水，取菌體置于其中。取一滴墨法與菌懸液混合，并且用另一載片之一端，將此水滴在載片上刮成薄膜，風干。
2、用純甲醇固家1min。
3、加0.5%蕃紅液數滴于涂片上沖去甲醇，并染色30S，然后傾去染液，立即吸干，鏡檢。
結果：背景黑色、莢膜無色，細胞紅色。
3、鞭毛染色法（用熒光假單細胞或普通變形菌）細菌鞭毛極為纖細，在普通光學顯微鏡下不能看到， 只有用特殊的染色方法，才能把鞭毛顯示出來。鞭毛染色的方法很多，但主要原理都是采取不穩定的膠體溶液做媒染劑，使在鞭毛上生成沉淀，加粗鞭毛的直徑使其達到光學顯微鏡辨晰限度以內。
步驟：
要染色的細菌應預先在新配制的斜面上傳5-6代。最后一代用的斜面部應放約0.5毫升的無菌水再進行接種。將最后一代長好的菌用細長吸管從底部取出放入1ml無菌水中制成菌懸液。放37℃溫箱活化半小時再取制片。
2、涂片 取一無劃痕且十分清凈無油脂的載片，可先將載片置于洗液中浸漬數日，用鑷子取后隨即以清水沖洗干凈（沖洗時勿用手指取捏玻片），再斜插于木架上，置37℃恒溫箱內任其干燥后備用。取上述菌懸液一滴，輕置玻片一端，玻片作傾斜放置，使菌液沿玻片順向下流，自成一薄菌膜。
3、干燥 讓其自然風干。
4、染色 先用染液A染2-4min,水沖洗,再用B液染30-60A,立即用水沖。
5、鏡檢。
結果：菌體的鞭毛呈黑色。