細菌生化反應檢查實驗

實驗材料 細菌

試劑、試劑盒 蛋白胨氯化鈉蒸餾水蛋白胨水葡萄糖乳糖甘露醇蔗糖麥芽糖溴甲酚紫溴麝香草酚蘭酚紅

儀器、耗材 試管糖發酵管

實驗步驟

一、細菌生化反應常用培養基的制備

1.  蛋白胨水

成分：蛋白胨1.0 g、氯化鈉0.5 g、蒸餾水100 ml。

將上述成分加熱溶解后校正pH7.6，分裝試管，15磅15 min高壓滅菌備用。常用于制備糖發酵培養基或用于檢查細菌的靛基質產生試驗等。

2.  糖發酵管

成分：蛋白胨水，葡萄糖、乳糖、甘露醇、蔗糖或麥芽糖等糖，溴甲酚紫(B.C.P)、溴麝香草酚蘭(B.T.B)或酚紅(P.R)等指示劑。

在蛋白胨水中加入某種糖(0.5～1%)和指示劑，分裝于帶一倒立小管的小試管中(圖2-5)，15磅20 min高壓滅菌后備用。常用于糖發酵試驗。

3. 葡萄糖蛋白胨水

成分：蛋白胨 　　　　0.5 g

葡萄糖 　　　　0.5 g

磷酸氫二鉀 　　0.5 g

蒸餾水 　　　　100 ml

上述成分混合溶化后校正pH至7.0，分裝試管，10磅20 min高壓滅菌備用。用于V-P試驗和甲基紅試驗。

4.  枸櫞酸鹽培養基

成分：枸櫞酸鈉 　　　　　　　　　0.2g

硫酸鎂 　　　　　　　　　　0.02g

磷酸二氫銨 　　　　　　　　0.1 g

磷酸氫二鉀 　　　　　　　　0.1 g

氯化鈉 　　　　　　　　　　0.5 g

瓊脂(經流水連續徹底漂洗) 　2.0 g

蒸餾水 　　　　　　　　　　100 ml

B.T.B酒精溶液(0.5%) 　　　1.6 ml

加熱溶化各種成分后校正pH至6.8，再加入0.5%B.T.B乙醇溶液混勻，分裝試管，8磅15 min高壓滅菌，趁熱取出置成斜面。 用于枸櫞酸鹽利用試驗。

5.  醋酸鉛培養基

成分：普通瓊脂培養基　　　 100 ml

硫代硫酸鈉 　　　　　0.25 g

醋酸鉛溶液(10%) 　　1 ml

先溶化普通瓊脂培養基，然后加入硫代硫酸鈉，校正pH為7.2，煮沸過濾，10磅20 min高壓滅菌，取出后無菌操作加入已滅菌的10%醋酸鉛溶液1 ml，混勻后裝于小試管，直立凝固后備用。用于檢測硫化氫的產生。

6.  尿素培養基

成分：蛋白胨 　　　　　　　　0.1 g

氯化鈉 　　　　　　　　0.5 g

磷酸二氫鉀 　　　　　　0.2 g

瓊脂 　　　　　　　　　2.0 g

蒸餾水 　　　　　　　　100 ml

酚紅溶液(0.6％) 　 　　0.2 ml

葡萄糖溶液(10％) 　　　0.1 ml

尿素(20％) 　　　　　　1 ml

在蒸餾水內加熱溶化蛋白胨、氯化鈉、磷酸二氫鉀和瓊脂，校正pH7.4，過濾后加入0.6%酚紅溶液混勻，8磅15 min高壓滅菌，取出待冷至60℃，加入滅菌的10%葡萄糖溶液和20%尿素，分裝于小試管內，凝成斜面備用。用于尿素分解試驗。

二、細菌生化反應檢查

1.  糖發酵(Fermentation of sugars)

將細菌接種于糖發酵管中，37℃培養18～24 h后觀察結果。必要時可培養更長時間后再判定結果。

細菌如分解糖時，則產酸，使指示劑變色(一般記錄符號是"十")；有些細菌在分解糖的同時還產生氣體，則倒立小管中有氣泡出現(記錄符號為"⊕")；如細菌不分解該糖時，指示劑不變色，不見培養液混濁(記錄符號為"―")。

2.  IMViC 包括下述四種試驗

（1） 靛基質產生(Production of indole)

將細菌接種于蛋白胨水中，37℃培養18～24 h。有些細菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸而產生靛基質，靛基質無色，不能直接查見，此時滴加數滴靛基質試劑(Kovacs試劑)于培養基的液面上，其接觸面呈玫瑰紅色者為陽性，仍呈黃色者為陰性，若顏色不明顯，可再加4～5滴乙醚，振蕩試管使乙醚分散于液體中，若培養液中有靛基質存在，就可以被提取至乙醚層中，顏色反應較為明顯。

(注)Kofacs試劑：取對二甲基氨基苯甲醛(Paradimethylaminobenzaldehyde)4g，加95%酒精380 ml，濃鹽酸80 ml即成。

（2） 甲基紅試驗(Methyl red test)

將細菌接種于葡萄糖蛋白胨水中，37℃培養48 h后，再向其中加入甲基紅試劑3滴。大腸桿菌等細菌分解葡萄糖產生丙酮酸，但丙酮酸不被縮合成乙酰甲基甲醇，培養基中酸多，pH值低，故呈紅色，為陽性。而產氣桿菌將丙酮酸縮合成乙酰甲基甲醇，培養基中酸少，pH值高，故呈黃色，為陰性。

注：甲基紅試劑：取甲基紅0.04 g，溶于60%的酒精100 ml中。該試劑酸性時呈紅色，堿性時呈黃色。

（3） V-P試驗(Voges-Proskauer test)

將細菌接種于葡萄糖蛋白胨水中，37℃培養48h后，再向培養基中加入等量的40%氫氧化鉀溶液(含有0.3%肌酸)。產氣桿菌分解葡萄糖生成丙酮酸，丙酮酸又被縮合成乙酰甲基甲醇，后者遇堿被空氣中氧氧化，生成二乙酰，二乙酰又和培養基中的胍基化合物發生反應，生成紅色化合物，培養基變紅色，是為V-P試驗陽性，其他細菌不能生成乙酰甲基甲醇，培養基不變色，為陰性。

（4） 枸櫞酸鹽利用試驗(Utilization of citrate)

將細菌接種于枸櫞酸鹽培養基上，37℃培養48 h。產氣桿菌等細菌能利用枸櫞酸鹽作為碳源，分解枸櫞酸鹽生成碳酸鹽，使培養基變為堿性，培養基中的指示劑由淡綠色轉為深藍色，為枸櫞酸鹽利用試驗陽性。大腸桿菌則不能分解枸櫞酸鹽，培養基顏色不變，為陰性。

3.  硫化氫產生試驗(Production of H2S)

將細菌穿刺接種于醋酸鉛培養基中，37℃培養24 h后觀察結果。有些細菌能分解培養基中的含硫氨基酸，生成硫化氫，穿刺部位呈黑褐色，是為反應陽性。培養基顏色無變化，則為陰性。

4.  尿素分解試驗(Splitting of urea)

將細菌接種于尿素培養基中，37℃培養18～24 h。變形桿菌能迅速(2～4 h)分解尿素產生大量的氨，使培養基變堿而呈紫紅色，是為陽性反應。

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