細菌的生化、生理實驗簡介（1）

微生物生化反應是指用化學反應來測定微生物的代謝產物，生化反應常用來鑒別一些在形態和其它方面不易區別的微生物。因此微生物生化反應是微生物分類鑒定中的重要依據之一，微生物檢驗中常用的生化反應介紹如下：
一、糖酵解試驗
不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異，或能利用或不能利用，能利用者，或產氣或不產氣。可用指示劑及發酵管檢驗。
試驗方法：以無菌操作，用接種針或環移取純培養物少許，接種于發酵液體培養基管中，若為半固體培養基，則用接種針作穿刺接種。接種后，置 36±1.0°C培養，每天觀察結果，檢視培養基顏色有無改變（產酸），小倒管中有無氣泡，微小氣泡亦為產氣陽性，若為半固體培養基，則檢視沿穿刺線和管壁及管底有無微小氣泡，有時還可看出接種菌有無動力，若有動力，培養物可呈彌散生長。本試驗主要是檢查細菌對各種糖、醇和糖苷等的發酵能力，從而進行各種細菌的鑒別，因而每次試驗，常需同時接種多管。一般常用的指示劑為酚紅、溴甲酚紫，溴百里藍和An-drade指示劑。
二、淀粉水解試驗
某些細菌可以產生分解淀粉的酶，把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再變藍色。
試驗方法：以18~24h的純培養物，涂布接種于淀粉瓊脂斜面或平板（一個平板可分區接種，試驗數種培養物）或直接移種于淀粉肉湯中，于 36±1°C培養24~48h，或于20℃培養5天。然后將碘試劑直接滴浸于培養表面，若為液體培養物，則加數滴碘試劑于試管中。立即檢視結果，陽性反應（淀粉被分解）為瓊脂培養基呈深藍色、菌落或培養物周圍出現無色透明環、或肉湯顏色無變化。陰性反應則無透明環或肉湯呈深藍色。
淀粉水解系逐步進行的過程，因而試驗結果與菌種產生淀粉酶的能力、培養時間，培養基含有淀粉量和pH等均有一定關系。培養基pH必須為中性或微酸性，以pH7.2最適。淀粉瓊脂平板不宜保存于冰箱，因而以臨用時制備為妥。
三、V-P試驗
某些細菌在葡萄糖蛋白胨水培養基中能分解葡萄糖產生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強堿環境下，被空氣中的氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱V－P（+）反應。
試驗方法：
1. O’Meara氏法：將試驗菌接種于通用培養基，于36±1°C培養48h，培養液1ml加O’Meara試劑（加有0.3%肌酸Creatine或肌酸酐Creatinine的40%氫氧化鈉水溶液）1ml，搖動試管1~2min，靜置于室溫或36±1°C恒溫箱，若4h內不呈現伊紅，即判定為陰性。亦有主張在48~50°C水浴放置2h后判定結果者。
2. Barritt氏法：將試驗菌接種于通用培養基，于36±1°C培養4天、培養液2.5ml先加入a萘酚（2-na-phthol）純酒精溶液 0.6ml,再加40%氫氧化鉀水溶液0.2ml，搖動2~5min，陽性菌常立即呈現紅色，若無紅色出現，靜置于室溫或36±1°C恒溫箱，如2h內仍不顯現紅色、可判定為陰性。

3. 快速法：將0.5%肌酸溶液2滴放于小試管中、挑取產酸反應的三糖鐵瓊脂斜面培養物一接種環，乳化接種于其中，加入5%α-萘酚3滴，40%氫氧化鈉水溶液2滴，振動后放置5min，判定結果。不產酸的培養物不能使用。
本試驗一般用于腸桿菌科各菌屬的鑒別。在用于芽胞桿菌和葡萄球菌等其它細菌時，通用培養基中的磷酸鹽可阻礙乙酰甲基醇的產生，故應省去或以氯化鈉代替。
四、甲基紅（Methyl Red）試驗
腸桿菌科各菌屬都能發酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產生丙酮酸，進一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產物，可使培養基PH值下降至pH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。
試驗方法：挑取新的待試純培養物少許，接種于通用培養基，培養于36±1°C或30°C（以30°C較好）3~5天，從第二天起，每日取培養液 1ml，加甲基紅指示劑1~2滴，陽性呈鮮紅色，弱陽性呈淡紅色，陰性為黃色。迄至發現陽性或至第5天仍為陰性、即可判定結果。

甲基紅為酸性指示劑，pH范圍為4.4~6.0，其pK值為5.0。故在pH5.0以下，隨酸度而增強黃色，在pH5.0以上，則隨堿度而增強黃色，在pH5.0或上下接近時，可能變色不夠明顯，此時應延長培養時間，重復試驗。
五、靛基質（Imdole）試驗
某些細菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應表現出來。吲哚與對二甲基氨基苯醛結合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。
試驗方法：將待試純培養物小量接種于試驗培養基管，于36±1°C培養24h時后，取約2ml培養液，加入Kovacs氏試劑2~3滴，輕搖試管，呈紅色為陽性，或先加少量乙醚或二甲苯，搖動試管以提取和濃縮靛基質，待其浮于培養液表面后，再沿試管壁徐緩加入Kovacs氏試劑數滴，在接觸面呈紅色，即為陽性。
實驗證明靛基質試劑可與17種不的靛基質化合物作用而產生陽性反應，若先用二甲苯或乙醚等進行提取，再加試劑，則只有靛基質或5-甲基靛基質在溶劑中呈現紅色，因而結果更為可靠。