各種微生物在代謝類型上表現了很大的差異。由于細菌特有的單細胞原核生物特性，這種差異就表現得更加明顯。不同細菌具有不同的酶系統，故不同細菌分解、利用糖類、脂肪類和蛋白類物質的能力不同，它們對物質的代謝譜和分解產物也就不同，利用這種特點建立細菌生化反應，在菌株的分類鑒定中具有主要意義。
【實驗目的】
1. 了解細菌鑒定中常用的生理生化試驗反應原理。
2. 掌握測定細菌生理生化反應的技術和方法。
【實驗原理】
各種細菌由于具有不同的酶系統，致使它們能利用不同的底物，或雖然可以利用相同的底物，卻產生不同的代謝產物，因此可以利用各種生理生化反應來鑒別細菌。
【試劑與器材】
1. 菌種 大腸埃希氏菌（Escherichia coli）、產氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）、普通變形桿菌（Proteus vulgaris）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的斜面菌種
2. 培養基 葡萄糖蛋白胨水培養基、蛋白胨水培養基、糖發酵培養基（葡萄糖、乳糖或蔗糖）
3. 試劑 40％NaOH溶液、肌酸、甲基紅試劑、吲哚試劑、乙醚、1.6%溴甲基酚紫指示劑。
4. 器具 超凈工作臺、恒溫培養箱、高壓滅菌鍋、試管、移液管、杜氏小套管。
5. 流程 糖發酵試驗→V-P試驗→甲基紅試驗→吲哚試驗。
【實驗方法與步驟】
1. 糖發酵實驗
① 試管標記 取分別裝有不同糖類（如葡萄糖、蔗糖和乳糖等）發酵培養液的試管，根據需要培養的細菌做好標記（如大腸埃希菌、產氣腸桿菌、普通變形菌等和空白對照）。
② 接種培養 以無菌操作分別接種少量菌苔至以上各相應試管中，空白對照中不接種，置37℃恒溫箱中培養，分別在培養24h、48h和72h觀察結果。
③ 觀察記錄 培養后各發酵管與空白對照相比，若接種培養液保持原有顏色，其反應結果為陰性，表明該菌不能利用該種糖，記錄用“－”表示；如培養液呈黃色，反應結果為陽性，表明該菌能分解該種糖產酸，記錄用“＋”表示。培養液中的杜氏小管內有氣泡為陽性反應，表明該菌分解糖能產酸并產氣，記錄用“＋”表示；如杜氏小管內沒有氣泡為陰性反應，記錄用“－”表示。
2. V.P.試驗
① 標記試管 取裝有葡萄糖蛋白胨培養液的試管，根據需要將培養的細菌做好標記。
② 接種培養 以無菌操作分別接種少量菌苔至以上相應試管中，空白對照管不接種，置37℃恒溫箱中，培養24～48h。
③ 觀察記錄 取出以上試管，振蕩2min。另取5支空試管相應標記菌名，分別加入3～5ml以上對應管中的培養液，再加入40％NaOH溶液10～20滴，并加入約0.5～1mg微量肌酸，振蕩試管，以使空氣中的氧溶入，置37℃恒溫箱中保溫15～30min后，若培養液呈紅色，記錄為V.P.試驗陽性反應（用“＋”表示）；若不呈紅色，記錄為V.P.試驗陰性反應（用“－”表示）。
注：原試管中留下的培養液用作甲基紅試驗。
3. 甲基紅試驗（M.R.試驗）
取裝有葡萄糖蛋白胨水培養液的試管，接種需培養鑒定的細菌，經過夜培養后，加入2～3滴甲基紅指示劑，注意沿管壁加入，仔細觀察培養液上層，若培養液上層變成紅色，即為陽性反應；若仍呈黃色，則為陰性反應，分別用“＋”或“－”表示。
4. 吲哚試驗
① 試管標記 取裝有蛋白胨水培養液的試管，根據需要培養的細菌做好標記。
② 接種培養 以無菌操作分別接種少量菌苔到以上相應試管中，第5管作空白對照不接種，置37℃恒溫箱中培養24～48h。
③ 觀察記錄 在培養液中加入5～10滴吲哚試劑，使試劑浮于培養物表面，形成兩層，觀察結果：如有吲哚存在，乙醚層呈現玫瑰紅色，此為吲哚試驗陽性反應，否則為陰性反應，陽性用“＋”、陰性用“－”表示。