一、目的要求
1、學習細菌染色的原理和方法；
2、掌握細菌的簡單染色法和革蘭氏染色法。
二、基本原理
用于生物染色的染料主要有堿性染料、酸性染料和中性染料三大類。堿性染料的離子帶正電荷，能和帶負電荷的物質結合。因細菌蛋白質等電點較低，當它生長于中性、堿性或弱酸性的溶液中時常帶負電荷，所以通常采用堿性染料（如美藍、結晶紫、堿性復紅或孔雀綠等）使其著色。酸性染料的離子帶負電荷，能與帶正電荷的物質結合。當細菌分解糖類產酸使培養基pH下降時，細菌所帶正電荷增加，因此易被伊紅、酸性復紅或剛果紅等酸性染料著色。中性染料是前兩者的結合物又稱復合染料，如伊紅美藍、伊紅天青等。
簡單染色法是只用一種染料使細菌著色以顯示其形態，簡單染色不能辨別細菌細胞的構造。
革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學家C.Gram所創立的。革蘭氏染色法可將所有的細菌區分為革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G-）兩大類，是細菌學上最常用的鑒別染色法。
細菌經結晶紫初染染成藍色。革蘭氏染色陽性菌（G+）細胞壁肽聚糖層數多，且肽聚糖為空間網狀結構，再經乙醇脫水，網狀結構更為致密，染料復合物不易從細胞內漏出，仍為藍色。而革蘭氏染色陰性菌（G-）細胞壁脂類含量多，肽聚糖層數少，且肽聚糖為平面片層結構，易被乙醇溶解，使細胞壁通透性增高，結合的染料復合物容易泄漏，細菌被脫色為無色，再經石炭酸復紅稀釋液復染成紅色。
三、實驗器材
1、菌種
培養12-16h的蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草桿菌（Bacillus subtilis），培養24小時的大腸桿菌（Escherichia coli）
2、染色液和試劑
結晶紫、盧哥氏碘液、95%酒精、蕃紅、復紅、二甲苯、香柏油
3、器材
廢液缸、洗瓶、載玻片、接種杯、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡
四、實驗方法及步驟
1、簡單染色
（1）涂片 取干凈載玻片一塊，在載玻片的左、右各加一滴蒸餾水，按無菌操作法取菌涂片，左邊涂蘇云金桿菌，右邊涂大腸桿菌，做成濃菌液。再取
干凈載玻片一塊將剛制成的蘇云金桿菌濃菌液挑2-3環涂在左邊制成薄的涂面，將大腸桿菌的濃菌液取2-3環涂在右邊制成薄涂面。亦可直接在載玻片上制薄的涂面，注意取菌不要太多。
（2）晾干 讓涂片自然晾干或者在酒精燈火焰上方文火烘干；
（3）固定 手執玻片一端，讓菌膜朝上，通過火焰2-3次固定（以不燙手為宜）；
（4）染色 將固定過的涂片放在廢液缸上的擱架上，加復紅染色1-2min；
（5）水洗 用水洗去涂片上的染色液；
（6）干燥 將洗過的涂片放在空氣中晾干或用吸水紙吸干；
（7）鏡檢 先低倍觀察，再高倍觀察，并找出適當的視野后，將高倍鏡轉出，在涂片上加香柏油一滴，將油鏡頭浸入油滴中仔細調焦觀察細菌的形態。
2、革蘭氏染色
（1）涂片 與簡單染色涂片相同；
（2）晾干 與簡單染色法相同；
（3）固定 與簡單染色法相同；
（4）結晶紫色染色 將玻片置于廢液缸玻片擱架上，加適量（以蓋滿細菌涂面）的結晶紫染色液染色1分鐘；
（5）水洗 傾去染色液，用水小心地沖洗；
（6）媒染 滴加盧哥氏碘液，媒染1min；
（7）水洗 用水洗去碘液；
（8）脫色 將玻片傾斜，連續滴加95%乙醇脫色20—25s至流出液無色，立即水洗；
（9）復染 滴加蕃紅復染5min；
（10）水洗 用水洗去涂片上的蕃紅染色液；
（11）晾干 將染好的涂片放空氣中晾干或者用吸水紙吸干；
（12）鏡檢 鏡檢時先用低倍，再用高倍，最后用油鏡觀察，并判斷菌體的革蘭氏染色反應性；
五 注意事項
1、革蘭氏染色成敗的關鍵是酒精脫色。如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而染成陰性菌；如脫色時間過短，革蘭氏陰性菌也會被染成革蘭氏陽性菌。脫色時間的長短還受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影響，難以嚴格規定，需要多加練習；
2、選用幼齡的細菌。G+菌培養12h-16h，E.coli培養24h。若菌齡太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉呈陰性反應.