細菌的簡單染色（Simplestain）和革蘭氏染色2

（3）固定：手執玻片一端，讓菌膜朝上，通過火焰2-3次固定（以不燙手為宜），使細胞質凝固，以固定細菌的形態，并使其不易脫落。但不能在火焰上烤，否則細菌形態將毀壞
（4）染色：將固定過的涂片放在廢液缸上的擱架上，加復紅染色1-2min
（5）水洗：用水洗去涂片上的染色液，直至沖下之水無色時為止。
（6）干燥：將洗過的涂片放在空氣中晾干或用吸水紙吸干。
（7）鏡檢：先低倍觀察，再高倍觀察，并找出適當的視野后，將高倍鏡轉出，在涂片上加香柏油一滴，將油鏡頭浸入油滴中仔細調焦觀察細菌的形態。
2、革蘭氏染色：
（1）涂片
（2）晾干
（3）固定，與簡單染色法相同
（4）結晶紫染色：將玻片置于廢液缸玻片擱架上，加適量（以蓋滿細菌涂面）的結晶紫染色液染色1分鐘；水洗：傾去染色液，用水小心地沖洗。
（5）媒染：碘液，媒染1min；水洗：用水洗去碘液。
（6）脫色：將玻片傾斜，連續滴加95%乙醇脫色20—25s至流出液無色，立即水洗。
（7）復染：滴加復紅復染3-5min；水洗：用水洗去涂片上的復紅染色液。
（8）晾干：將染好的涂片用吸水紙吸干。
（9）鏡檢：鏡檢時先用低倍，再用高倍，最后用油鏡觀察，并判斷菌體的革蘭氏染色反應性。
（10)實驗完畢后的處理：
①將浸過油的鏡頭按下述方法擦拭干凈，
a.先用擦鏡紙將油鏡頭上的油擦去。
b.用擦鏡紙沾少許乙醚-乙醇混合液將鏡頭擦2-3次。
c.再用干凈的擦鏡紙將鏡頭擦2-3次。注意擦鏡頭時向一個方向擦拭。將顯微鏡小心輕拿，按號放入顯微鏡柜中。
②觀察后的染色玻片用廢紙將香柏油擦干凈，放入回收容器內。
五.注意事項
1.革蘭氏染色成敗的關鍵是酒精脫色。如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而染成陰性菌；如脫色時間過短，革蘭氏陰性菌也會被染成革蘭氏陽性菌。脫色時間的長短還受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影響，難以嚴格規定。
2.染色過程中勿使染色液干涸。用水沖洗后，應吸去玻片上的殘水，以免染色液被稀釋而影響染色效果。
3.選用幼齡的細菌。G+菌培養12h-16h，E.coli培養24h。若菌齡太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉呈陰性反應。