細胞抽提物的制備
核糖體及多核糖體的分離
70S核糖體的純化
多核糖體的純化
將核糖體解離為大亞基和小亞基
| 實驗材料 | 細胞 |
|---|---|
| 試劑、試劑盒 | 弗氏破碎緩沖液 勻漿緩沖液 |
| 儀器、耗材 | 弗氏破碎器 |
| 實驗步驟 | 1. 將 5~10 g 新鮮或凍存的細胞沉淀物垂懸于弗氏破碎緩沖液中或者適當的勻漿緩沖液中。通常 4L 的大腸桿菌培養物可以獲得大約 7.5 g 的細胞沉淀。 2. 懸液中加入無 RNase 的 DNase 至終濃度為 2 μg/ml 并在 4℃ 中放置 20 分鐘。 3. 細胞破碎： (1) 真細菌的 70S 核糖體 弗氏破碎緩沖液： 20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5 50 mmol/L MgOAc 100 mmol/L NH4Cl 1.0 mmol/L DTT 0.5 mmol/L EDTA 細胞在弗氏破碎器中以每平方英寸 16000 磅的壓力破碎 1 分鐘。 (2) 真細菌多核糖體 弗氏破碎緩沖液： 20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.6 50 mmol/L MgCl2 150 mmol/L NH4CI 細胞在弗氏破碎器中以每平方英寸 13800 磅的壓力破碎 1 分鐘。 (3) 哺乳動物核糖體 將組織切碎并重懸于兩倍體積的勻漿緩沖液： ① 哺乳動物勻漿緩沖液： 50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5 5 mmol/L MgCl2 25 mmol/L KCl 0. 2 mol/L 蔗糖 將懸液在玻璃勻漿器中用一只馬達驅動的寬松配置的聚四氟乙烯研杵搗 8~10 下，使之勻漿化。 如果核糖體來自網織紅細胞，則重懸于 2 倍體積的網織紅細胞勻漿緩沖液。 ② 網織紅細抱勻漿緩沖液： 10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5 1.5 mmol/L MgCl2 10 mmol/L KCl 2 mmol/L DTT 用玻璃勻漿器和手持的寬松配置的聚四氟乙稀研桿搗 3 次使懸液勻漿化。 (4) 植物核糖體和多核糖體 將植物組織用 0.1% 的 DEPC 處理過的 H2O 于室溫下清洗。將組織在液氮中冷凍后用冷的研缽和研杵搗碎成細的粉末。 將粉末重懸于 2 倍體積冷的植物抽提緩沖液中： 植物抽提緩沖液 50 mmol/L Tris-HCl，pH 9.0 30 mmol/L MgCl2 400 mmol/L KCl 17% 蔗糖 將懸液在一個磨碎器中每隔 1 分鐘施加一次 15 秒的脈沖，重復 4 次使之勻漿化將勻漿液先用 2 層 DEPC 處埋過的冷的紗布（Fisher) 過濾，然后再用 8 層紗布過濾。 (5) 葉綠體核糖體 用 dH2O 清洗植物組織（菠菜葉，250 g），然后懸于 250 ml 的葉綠體勻漿緩沖液中： 葉綠體勻漿緩沖液： 100 mmol/L Tris-HCI，pH 7.5 5 mmol/L MgOAc 50 mmol/L KCl 5 mmol/L β-巰基乙醇 0.7 mol/L 蔗糖 將懸液在磨碎器中勻漿處理 45 秒，然后用冷的 DEPC 處理過的紗布過濾。 于 2℃ 以 360 g 離心 5 分鐘使抽提物澄清，然后以 1200 g 離心 15 分鐘使葉綠體沉淀下來。用葉綠體勻漿緩沖液洗沉淀物然后再離心沉淀。 為了破碎膜并裂解葉綠體，將葉綠體沉淀重懸于含有脫氧膽酸鈉（終濃度為 0.5% ) 或 Triton X-100 ( 終濃度為 1.0% ) 的 50 ml 裂解緩沖液中。 葉綠體裂解緩沖液： 100 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5 10 mmol/L MgOAc 50 mmol/L NH4CI 6 mmol/L β-巰基乙醇 4. 用 Sorvall SS-34 轉頭于 4℃ 離心除去裂解物中的細胞碎片，離心速度和時間如下： (1) 對于原核 70S 核糖體，以 30000 g 離心 30 分鐘。 (2) 對于真核多核糖體，以 7700 g 離心 8 分鐘，保留上清，用于作多核糖體的純化步驟。 (3) 對于哺乳動物核糖體，以 20000 g 離心 10 分鐘。 (4) 對于植物核糖體和多核糖體，以 1000 g 離心 7 分鐘，向上清中加入 0.1 體積的 20% Triton X-100 然后以 16000 g 離心 20 分鐘。 (5) 對于植物葉綠體，以 26000 g 離心 20 分鐘。 |
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