細菌細胞的制備實驗實驗_將核糖體解離為大亞基／小亞基

核糖體

解離緩沖液貯存緩沖液

1. 通過將核糖體樣品對解離緩沖液透析并用 7%~30% 的線性蔗糖梯度離心來將真細菌 70S 核糖體分離為 30S 和 50S 亞基。

解離緩沖液：

10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5

1 mmol/L MgOAc

100 mmol/L NH₄Cl

1 mmol/L DTT

0.5 mmol/L EDTA

2. 測量樣品在 A₂₆₀ 下的光吸收，將樣品用解離緩沖液稀釋至每毫升 100~150 A₂₆₀。

3. 將樣品于 4℃ 對解離緩和液透析 5 分鐘。

4. 用解離緩沖液制備 7% 和 30% 的蔗糖溶液。用 Millipore 過濾蔗糖溶液。

5. 線性蔗糖梯度可以按前述方法在 Beckman Vti 50 轉頭配套的管中制備。制備 37 ml 梯度和 2 ml 樣品。在梯度的制備中，應自下而上地先向管底倒入 18.5 ml 7% 蔗糖溶液，然后倒入 18.5 ml 30% 的蔗糖溶液，從而使濃度漸高的蔗糖將低密度的蔗糖托起。于 4℃ 放置 2~16 小時使梯度形成。

6. 于 42℃ 保溫 5 分鐘使樣品熱激活，然后向每個梯度中加載 150~200 A₂₆₀ 單位的樣品。

7. 將梯度于 4℃ 以 50000 r/min ( 242000 g ) 離心 70 分鐘。

8. 對梯度進行分部收集（每 30 滴為一個分部），確定 A₂₆₀ 曲線，分別倒出單個亞基峰的收集液，用 Beckman 50.2 Ti 轉頭以 30000 r/min 離心 16 小時來沉淀亞基。

9. 為確保每一亞基樣品中含有的其他亞基或其他蛋白質的污染少于 0.5%，可以將亞基作兩次梯度離心。

10. 將亞基沉淀物存于 -80℃ 中長期貯存。為便于使用，將沉淀重懸于少量體積的貯存緩沖液中并貯存于 -80℃。

貯存緩沖液：

20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5

10 mmol/L MgOAc

100 mmol/L NH₄CI

1 mmol/L DTT

0.5 mmol/L EDTA

60% 甘油

11. 用 1.5 % 的瓊脂糖凝膠電泳確定亞基的純度。從每一份樣品中取一份與等體積的 RNA 凝膠上樣緩沖液混合，緩沖液為 0.5% 的 SDS，40% 蔗糖的水溶液。

(1) 哺乳動物核糖體

① 將多核糖體沉淀重懸于哺乳動物解離緩沖液中，于 4℃ 保溫 15 分鐘。

哺乳動物解離緩沖液：

50 mmol/L 鹽酸三乙醇胺，pH 7.5

5 mmol/L MgCl₂

500 mmol/L KCI

1 mmol/L 嘌呤霉素

② 保溫后，加入 MgCl₂ 至終濃度為 50 mmol/L。將樣品用 Beckman Ti 60 轉頭于 4℃ 以 305000 g 離心 5 小時。將沉淀重懸于不含嘌吟霉素的解離緩沖液中。

③ 用不含嘌呤霉素的解離緩沖液制備 10% 和 40% (w/w) 的蔗糖溶液。如同真細菌核糖體亞基解離方法中描述的一樣，將 0.5 ml 等份鋪于 12 ml 的 10%~40% 線性蔗糖梯度之上。

④ 將梯度用 Beckman SW41 轉頭于 4℃ 以 190000 g 離心 5 小時。后續步驟同真細菌核糖體分離方法中的一樣。

(2) 葉綠體核糖體

① 將核糖體沉淀重懸于葉綠體解離緩沖液中：

葉綠體解離緩沖液：

10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5

50 mmol/L NH₄CI

0.1 mmol/L MgOAc

6 mmol/L β-巰基乙醇

② 用以上緩沖液制備 7%~30% 的線性蔗糖梯度。按照真細菌核糖體亞基解離步驟中的方法制備梯度。

③ 將樣品鋪于梯度之上，然后用 Beckman VTi 50 轉頭于 4℃ 以 50000 r/min ( 242000 g）離心 70 分鐘。后續步驟同真細菌核糖體分離方法中的一樣。