一、實驗目的
1.熟悉薄層層析的操作步驟。
2.掌握薄層層析法分析細菌細胞壁糖的原理和方法。
二、實驗原理
簿層層析是一種微量而快速的層析方法。該方法是把吸附劑或支持劑(例如硅膠或硅藻土)涂在玻璃板上成為一簿層，將要分析的樣品滴加到薄層上，然后用合適的溶劑進行展開，使樣品中各個成分分離，最后進行定性鑒定和定量測定。因為層析是在吸附劑的薄層上進行的，所以稱為薄層層析。實際上，薄層層析和柱層析、紙層析在原理上和操作上都是很相似的。柱層析是把吸附劑裝在管中形成一個柱，在柱上進行分離。紙層析是用紙作為支持劑進行層析。薄層層析則是用鋪于玻璃板上的吸附劑薄層進行層析。但是薄層層析兼備了柱層析和紙層析兩者的優點。因為薄層層析是在敞開的薄層上操作的，所以它和紙層析一樣，在確定混合的組分是否分開和顯色等方面都比較方便，只要把顯色劑直接噴到薄層上即可觀察．而柱層析則要把層析譜從柱中推出或進行洗脫，然后分段收集洗脫液才能設法鑒定。在顯色方面，紙層析不能用腐蝕性的顯色劑，而薄層層析(如果用硅膠、氧化鋁、硅藻土等無機物鋪成薄層)卻能耐受濃硫酸等試劑的作用。柱層析所需的樣品量較大，不適于小量樣品的分離；紙層析只適用于小量樣品的分離；薄層層析則適應樣品量范圍大，一般為1μg～500mg，靈敏度高。薄層層析的另一突出的優點是展開的時間特別短(一般為幾到幾十分鐘)，這樣迅速而有效的分離效果是柱層析和紙層析所不可比擬的。由于薄層層析具有以上這些優點，而且操作方便，設備簡單，所以薄層層析方法發展很快，應用范圍廣泛。
目前已知，細胞壁組成成分中氨基酸組分占有很高比例，與這些氨基酸相聯系的變化組分是糖和氨基糖。通常，每個細菌的屬具有一個特征性的細胞壁組成成分，在一個屬中糖在相對比例上的變化，可以區分不同的種。因此細胞壁的組分之一糖的分析鑒定，在細菌分類中有著重要的意義。糖的分析已列為細菌分類的生化指標之一。特別是對棒狀菌和放線菌來說，細胞壁中的糖是重要的分類指標。本實驗采用了具有吸附層析原理的硅膠薄層層析．來分離鑒定細菌細胞壁中所含的糖類物質，為細菌的分類檢索提供生化組成方面的依據。
三、儀器、原料和試劑
儀器
搖床、超聲波發生器，功率150w、離心機、安管、5cm×15cm 玻璃板、吹風機、烘箱、酒精水平儀、噴霧器。
原料
枯草芽孢桿菌。
試劑
1. 菌體培養基
2. 0.05mol/LpH7.6磷酸鹽緩沖液
3. 胰蛋白酶
4. 氫氧化鈉
5. 羧甲基纖維素
6. 0.8％生理鹽水
7. 2mol/L 的鹽酸
8. RNA 酶
9. 硅膠H
10. 乙酸乙酯
11. 甲醇
12. 乙酸
13. 已知糖溶液：稱取標準糖鼠李糖、甘露糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖各50mg，分別溶于5mL 水。
已知糖混合液：將上述糖溶液以等體積混合。
14. 苯胺—二苯胺—磷酸試劑：4g 二苯胺，4mL 苯胺及20mL85%磷酸溶于200mL 丙酮。苯胺存放時間過久，顏色變成棕黃色，需重配后使用。
15. 茴香醛—硫酸試劑：取0.5mL 茴香醛加到50mL 乙酸中，混勻，再加入1mL 濃硫酸。臨用前配制。
16. 1，3—二羥基萘酚—硫酸試劑：20mg1，3—二羥基萘酚加10mL 乙醇，再加0.2mL 濃硫酸。