細菌的芽孢染色(sporestaining)

實驗原理
細菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易著色，若用一般染色法只能使菌體著色而芽胞不著色（芽孢呈無色透明狀）。芽孢染色法就是根據芽孢既難以染色而一旦染上色后又難以脫色這一特點而設計的。所有的芽孢染色法都基于同一個原則：除了用著色力強的染料外，還需要加熱，以促進芽孢著色。當染芽孢時，菌體也會著色，然后水洗，芽孢染上的顏色難以滲出，而菌體會脫色。然后用對比度強的染料對菌體復染，使菌體和芽孢呈現出不同的顏色，因而能更明顯地襯托出芽孢，便于觀察。

實驗器材
1.活材料
培養36小時的蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草桿菌（Bacillus subtilis）。
2.染色液和試劑
5%孔雀綠水溶液、0.5%蕃紅水溶液。
 
3.器材
小試管（75mm×10mm）、燒杯（300mL）、滴管、玻片擱架、接種環、擦鏡紙、鑷子、顯微鏡等。

實驗方法
1.改良的Schaeffer和Fulton氏染色法
（1）制備菌液：加1—2滴無菌水于小試管中，用接種環從斜面上挑取2—3環的菌體于試管中并充分打勻，制成濃稠的菌液。
（2）加染色液：加5%孔雀綠水溶液2—3滴于小試管中，用接種環攪拌使染料與菌液充分混合。
（3）加熱：將此試管浸于沸水浴（燒杯），加熱15—20min。
（4）涂片：用接種環從試管底部挑數環菌液于潔凈的載玻片上，做成涂面，晾干。
（5）固定：將涂片通過酒精燈火焰3次。
（6）脫色：用水洗直至流出的水中無孔雀綠顏色為止。
（7）復染：加蕃紅水溶液染色5min后，傾去染色液，不用水洗，直接用吸水紙吸干。
（8）鏡檢：先低倍，再高倍，最后用油鏡觀察。
結果：芽孢呈綠色，芽孢囊和菌體為紅色。
2.Schaeffer與Fulton氏染色法
（1）涂片：按常規方法將待檢細菌制成涂片。
（2）晾干固定：待涂片晾干后在酒精燈火焰上通過2—3次。
（3）染色：
①加染色液：加5%孔雀綠水溶液于涂片處（染料以鋪滿涂片為度），然后將涂片放在銅板上，用酒精燈火焰加熱至染液冒蒸汽時開始計算時間，約維持 15-20min。加熱過程中要隨時添加染色液，切勿讓標本干涸。（加熱時溫度不能太高）。
②水洗：待玻片冷卻后 ，用水輕輕地沖洗，直至流出的水中無染色液為止。
③復染：用蕃紅液染色5min。
（4）水洗、晾干或吸干。
（5）鏡檢：先低倍，再高倍，最后在油鏡下觀察芽孢和菌體的形態。
結果：芽孢呈綠色，菌體為紅色。

注意事項
1.供芽孢染色用的菌種應控制菌齡。
2.改良法在節約染料、簡化操作及提高標本質量等方面都較常規涂片法優越，可優先使用。
3.用改良法時，欲得到好的涂片，首先要制備濃稠的菌液，其次是從小試管中取染色的菌液時，應先用接種環充分攪拌，然后再挑取菌液，否則菌體沉于管底，涂片時菌體太少。