實驗概要
本實驗介紹了細菌的轉化與平板篩選的原理及操作步驟。
實驗原理
感受態是指細菌處于容易吸收外源DNA的狀態。轉化是指質粒DNA或以它為載體構建的重組子導人細菌的過程。其原理是細菌處于0℃，CaCl2低滲溶液中，菌細胞膨脹成球形。轉化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基—鈣磷酸復合物粘附于細胞表面，經42℃短時間熱擊處理，促進細胞吸收DNA復合物。將細菌放置在非選擇性培養基中保溫一段時間，促使在轉化過程中獲得的新的表型(如Ampr等)得到表達，然后將此細菌培養物涂在含有氨芐青霉素的選擇性培養基上。
重組質粒轉化宿主細胞后，還需對轉化菌落進行篩選鑒定。利用α互補現象進行篩選是最常用的一種鑒定方法。現在使用的許多載體都具有一段大腸桿菌β半乳糖苷酶的啟動子及其編碼α肽鏈的DNA序列，此結構稱為lacZ'基因。lacZ'基因編碼的α肽鏈是β半乳糖苷酶的氨基端的短片段(146個氨基酸)。任何攜帶著lacZ'基因的質粒載體轉化了染色體基因組存在著此種β半乳糖苷酶突變的大腸桿菌細胞后，便會產生出有功能活性的半乳糖苷酶，在IPTG(異丙基β-D-硫代半乳糖苷)誘導后，在含有Xgal(5-溴-4-氯-3-吲哚-6-D-半乳糖苷)的培養基平板上形成藍色菌落（半乳糖苷酶能將無色的化合物Xgal切割成半乳糖和深藍色的底物5-溴-4-靛藍）。而當有外源DNA片段插入到位于lacZ'中的多克隆位點后，就會破壞α肽鏈的閱讀框，從而不能合成與受體菌內突變的β半乳糖苷酶相互補的活性α肽，而導致不能形成有功能活性的β半乳糖苷酶，也就不能分解Xgal而顯藍色，因此含有重組質粒載體的克隆往往是白色菌落。
主要試劑
1. 0.1mol／L CaCl2溶液
2. LB液體培養基及LB固體培養基
3. 氨芐青霉素(Amp)：用無菌水配制成100mg／mL溶液，置-20℃冰箱保存。
4. Xgal：將Xgal溶于二甲基甲酰胺，配成20mg／mL，不需過濾滅菌，分裝小包裝，避光貯存于-20℃。
5. IPTG：取2g IPTG溶于8mL雙蒸水中，再用雙蒸水補至10mL，用0.22um濾膜過濾除菌，每份1mL，貯存于-20℃。
主要設備
1. 超凈工作臺
2. 低溫離心機
3. 恒溫搖床
4. 恒溫箱
5. 恒溫水浴
6. 離心管
7. 試管
8. 培養皿
9. 錐形瓶
10. 接種針
11. 玻璃涂棒
12. 酒精燈
13. 鑷子及牙簽
實驗材料
1. 大腸桿菌DH5α
2. 質粒
實驗步驟
1. 制備感受態細胞
1) 吸取15μl E.coil菌液，接種于20ml LB液體培養基中，37℃振蕩培養過夜，待OD600=0.5左右將該菌懸液以1：50接種量轉于50ml LB液體培養基中，37℃振蕩擴大培養，當培養液開始出現混濁后，每隔20-30min測一次OD600，至OD600=0.6左右，停止培養。
2) 培養液轉入離心管中，在冰浴10min，4℃下5000rpm離心10min。
3) 棄上清液，用4ml冰預冷的0.1M CaCl2溶液輕輕懸浮菌體至均勻，冰上放置30min。
4) 4℃下5000rpm離心6min。
5) 棄上清液，用2ml冰預冷的0.1M CaCl2溶液輕輕懸浮菌體至均勻，冰上放置片刻后即制成感受態細胞懸液。
6) 以上制好的感受態細胞懸液可在冰上放置，24小時內直接用于轉化實驗，也可加入15%高壓滅菌過的甘油，混勻后，分裝于1.5ml離心管中，每管100μ l感受態細胞懸液，置-70℃條件下保存。.
2. 質粒DNA轉化大腸桿菌
1) 取100μl搖勻后的感受態細胞懸浮液（如是冷凍保存液，則需化凍后馬上進行下面的操作），加入5μl連接產物，輕輕搖勻，冰上放置30min后，于42 IPTG水浴中保溫90s，然后迅速在冰上冷卻2min。
2) 加入900μl LB液體培養基，則總體積約1ml，混勻于37℃振蕩培養90分鐘使受體菌恢復正常生長狀態并使轉化體產生抗藥性Ampr。
3) 在預制的LB瓊脂平板上，加40uL 20mg／mL的Xgal和4uL 200mg／mL的IPTG溶液，并用滅菌玻璃推子(酒精燈上燒后冷卻)，均勻涂布于瓊脂凝膠表面，37℃倒置吸收。
4) 將恢復培養的菌體4000rpm離心5min，移去上層900μl LB培養基，用余下的100μl重懸菌體至均勻。
3. α互補現象的檢查
將重懸菌體均勻涂布于含X-gal加IPTG加氨芐青霉素的LB平板上，37℃倒置培養12-24h，出現菌落。其中白色菌落從理論上講為重組克隆。
如果進一步驗證，可挑取多個白色菌落分別接種到1ml含有氨芐青霉素的LB液體培養基中，37℃振蕩培養6-8h，然后提取質粒酶切驗證，或進行菌落PCR擴增鑒定。
注意事項
1. 細菌生長狀態和密度：不要用經過多次轉接和貯存于-4℃的培養菌，最好從-70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉接用于制備感受態細胞的菌液。細菌生長密度則以剛進入生長對數期為好。
2. 防止雜菌和雜DNA的污染：整個操作過程均應在無菌條件下進行。