細菌RNA制備實驗

RNA

STET 氯仿 乙酸鈉 氯化銫 無水乙醇 EDTA

離心機 分光光度計 搖床

1.  培養100 ml 大腸桿菌或500 ml 藍細菌至對數生長期，加入1/20體積終止緩沖液，置于冰上。

2.  于4℃用JA-10轉子17 700 g 離心5 min 收集細胞。

3.  用2 ml STET裂解液重懸細胞，加入100 μl 0.2 mol/l 的VRC，移入15 ml 聚丙烯管子。

4.  加入1 ml 緩沖液平衡酚，振蕩1 min 再加1 ml 氯仿，振蕩1 min，于4℃用JA-17轉子10 000 g 離心10 min，收集水相。

5.  加入1/10體積3 mol/l 乙酸鈉和2倍體積冰冷無水乙醇，于4℃ 10 000 g 離心10 min。

6.  用2 ml 0.2 mol/l VRC溶液重溶沉淀。

7.  用1：1酚/氯仿抽提2遍后，按步驟5重新沉淀。

8.  如用TLA-100.3轉子

（1）重溶沉淀于2 ml DEPC處理水中，加1 g 固體CsCl并使之完全溶解。

（2）取2.25 ml 加在13 mm ×51 mm TLA-100.3聚碳酸酯超離心管的0.75 ml CsCl墊層之上，于20℃ 280 000 g 離心1 h。

9.  如用SW-41轉子

（1）重溶沉淀于6 ml DEPC處理水中，加入4.5 g 固體CsCl并使之完全溶解。

（2）補加DEPC處理水至9 ml，并將其加在14 mm×89 mm Ultraclear超離心管的3 ml CsCl墊層之上，于20℃150 000 g 離心24 h。

10.  用無菌巴斯德吸管小心地移去界面的DNA層，然后移去上層CsCl液，傾去殘余液體，作一記號標記RNA沉淀的所在。

11.  用紙巾擦干離心管壁，沉淀用0.36 ml DEPC處理水重溶并移至1.5 ml 的微量離心管中。

12.  加入1/10體3 mol/l 乙酸鈉和2.5倍體積冰冷無水乙醇，于-70℃沉淀20 min，于4 ℃用微量離心機高速離心5 min。

13.  RNA沉淀加入1 ml 冰冷70%乙醇，再于4℃用微量離心機高速離心5 min。

14.  晾干沉淀，并溶解于200 μl DEPC處理過的水，測A₂₆₀和A₂₈₀定量RNA。

15.  最后調節濃度至4 μg/μl，于-70℃長期保存或以乙醇沉淀的形式保存。