| 實驗材料 | 用 Vacutainer (BectonDickinson) 或加有不含防腐劑的肝素納.（25U ml) 的注射 器 獲取肝素化的全血 |
|---|---|
| 試劑、試劑盒 | 完全的 RPMI 10% FBS (胎牛血清）培養基 100 X 植物血凝素 氨甲蝶呤 脫氧胸嘧啶核苷 秋水仙素 氯化鉀 固定劑 |
| 儀器、耗材 | 無菌錐形聚丙烯離心 TB注射器 |
| 實驗步驟 |
基本方案 外周血培養和分裂中期細胞收獲
1.應用含有肝素鈉的 Vacutainer 或含有 25U/ml 血的無防腐劑肝素鈉（不要應用其他抗凝劑）的注射器，經靜脈穿刺采集外周血。盡快開始培養（推薦），或 4°C 保存不超過 4d。室溫運輸。
2.用帶有 21 G 針頭的 TB 注射器，接種 0.25 ml 全血至無菌 15 ml 聚丙烯離心管，內含 5 ml 完全 RPMI，其中含有 10%FBS 及慶大霉素。<3 周的新生兒加全血 0.2 ml，任何一管中都不要超過 0.5 ml。加人重新溶解的 100XPHA0.05 ml。
3a. 標準樣品：培養管傾斜 45°(—定的角度有利于空氣交換并防止沉淀堆積）培養 2~4d(最佳 3d)。
3b. 新生兒：如描述的直接收獲或培養 1~2d 后收獲（2d 最佳)。
3c. 老年人：此年齡組的淋巴細胞對 PHA 的反應較慢，因此在培養 3~4d 后收獲。
4.可選方案：對于較長的染色體和更多的有絲分裂細胞，應用以下的方法（圖 4.1.1) 可獲得更好的同步化細胞。收獲前一天，加人 0.05 ml 的 10 mmol/L 氨甲蝶呤（終濃度為 10—7mol/L) 以阻斷 DNA 復制。繼續培養 16~18 h(不超過 18 h)。第二天，加入 0.05 ml 的 lmmol/L 脫氧胸嘧啶核苷（終濃度為 10-5mol/L) 以解除氨甲蝶呤的阻斷作用。繼續培養約 4 h(時間是關鍵因素）。
5.培養 3~4d(第 3 步），或同步化（第 4 步）后，直接加入 lOug/ml 秋水仙素 25ul (終濃度為 O.OSug/ml)，啟動收獲，孵育 30 min。室溫 180 g 離心 8 min，棄上清。
6.于室溫加入 75 mmol/LKa 溶液 6 ml，并輕輕地使細胞重懸。室溫靜置 15 min，根據沉淀物體積調整 KCl 體積以達到最佳條件，比延長時間更有效。
7.用巴氏管加入固定劑 10~12 滴，混勻。離心，同第 5 步。
8.保留 0.5 ml 上清，利用巴氏管輕輕吹吸，使棕色的塊狀物重新懸浮。避免吸入過多而使其黏附于玻璃管上。勿將吸管前端緊壓管底。加入 1 ml 固定劑并立即輕輕混勻，以固定劑調整體積至 5 ml 并混勻。離心，同第 5 步。
9.棄上清，以 5 ml 固定劑重懸沉淀物，離心，同第 5 步。
10.棄上清，以適當體積固定劑重懸沉淀物至類似稀牛奶的混懸液。室溫靜置 30 mm，或 4°C 過夜（較長固定時間有利于染色體分散)。
11.制片，分析分散開的染色體（支持方案)。
支持方案 染色體玻片制備
此方法適用于多種方法培養的細胞：外周血、骨髓（單元 10.1)、腹水、胸水、羊水（單元 8.2) 和培養瓶收獲細胞（單元 8.1、單元 8.3 和單元 10.2)，雜交或放射雜交體細胞（單元 3.1)，淋巴細胞株，非人類的雜交瘤細胞。總之，該方法適合于任何經培養、固定的有絲分裂細胞懸液制備染色體玻片。
1.從甲醇中取出玻片，用不含棉的絨布擦凈（玻片務必潔凈）。再次將玻片浸人甲醇，然后以去離子水反復沖洗，直至將甲醇沖凈，*并且在玻片表面留有均勻的一層水膜。
2.以拇指和食指拿住玻片磨砂的一端，傾斜玻片使其長邊與工作臺面平行，用吸水紙接觸玻片下側長邊，吸干玻片上多余水分。使玻片傾斜于工作臺面呈 30。角，并使玻片下側的長邊與吸水紙保持接觸，有水層的一面向上（圖 4.1.2)。
3.水平持巴氏管于玻片上方 1~2in 處，連續、均勻滴加細胞混懸液 3 滴，移動方向朝向磨砂一端。每一滴平均占有玻片的 1/3 寬度，滴在傾斜玻片上的液滴，在其接觸到玻片的同時撥散開來。如果細胞分散的面積集中在液滴滴下位置，液滴周圍細胞較少，則應在滴片時減小玻片與工作臺之間的角度（<30°)
4.吸去多余的固定劑，按照第 2 步使玻片傾斜 30°，滴加新鮮配制的固定劑，用巴氏管一滴一滴地滴加。從抬高的無磨砂的一端開始移向磨砂的一端，滴在玻片抬高的邊緣，形成均勻的固定劑的前端。
5.再次吸干玻片下側長邊邊緣水分，并將玻片背面擦干。將玻片磨砂端向上傾斜 30。，滴有細胞的一面向上，于空氣中晾干，使其充分分散。如果玻片周邊細胞分散效果不佳，可參見表 4.1.1 操作（如調整溫度為 20?22°C，相對濕度為 50%)。
6.在相差顯微鏡下尋找形態及分散良好的染色體觀察。祧選染色體分布均勻、一致、密度適中且沒有染色體相互重疊的玻片，為了利于獲得理想的染色體條帶或雜交信號，理想的染色體應平整、條帶分明、著色一致。
7.玻片儲存在清潔、干燥、陰暗處，室溫（短期）或一 70°C 凍存（長期）保存。
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