結核分枝桿菌熒光定量PCR檢測方法的建立與應用

結核病是嚴重危及全球的公共衛生問題之一，自1985年以來結核病疫情在全球范圍內急劇上升，據世界衛生組織報道，目前全球有近1/3的人感染了結核桿菌，即20億人口感染了結核桿菌，其中活動性肺結核病人約2 000萬，每年新增結核病人約800～1 000萬，每年約有300萬人死于結核病［1～3］。結核病已成為導致全世界成人因傳染病而死亡的主要疾病之一。我國是全球22個結核病高發國家之一，活動性肺結核病人數居世界第二位。據2000年全國結核病流行病學抽樣調查估計，全國現有活動性肺結核病人450萬，其中傳染性肺結核病人150萬［4］。結核病防治是我國乃至全球疾病防治的重要課題。目前，出入境人員體檢診斷傳染性肺結核的主要方法是通過胸部X片檢查，加上痰涂片抗酸染色鏡檢和PPD試驗聯合檢測。由于胸部X片是根據臨床癥狀進行診斷，缺乏病原學依據，加上肺結核與其他肺部疾病在胸片上有相似的地方，容易出現誤診和漏診；痰涂片抗酸染色的陽性率低，采樣不合格標本的陽性率更低，極易出現漏診；而PPD試驗的特異性不強，不能作為確診肺結核的依據。因此，這三種檢測方法的組合模式在檢測肺結核上存在著較大的缺陷，易導致傳染性肺結核病人的漏診，而少數肺部疾病或其他部位結核的病人可能出現誤診，降低了出入境人員傳染性肺結核監測的效果。分子生物學方法以其簡便、快速，特異性高的特點成為結核分枝桿菌檢測研究的熱點。國內外大量研究證明PCR檢測結核分枝桿菌敏感性達到100％，本研究以熒光PCR技術為基礎，開發適合傳染性肺結核快速診斷模式，結果報告如下。

　　1  材料與方法

　　1.1  材料 

　　確診肺結核病人培養涂陽的結核痰液標本102份。正常人的痰液25份，葡萄球菌、肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯球菌痰液標本共計20份。

　　1.2 引物與探針 

　　根據對NCBI數據庫結核桿菌基因序列分析，找出其保守序列，并且在此區域應用Primer5.0 和Primer express 3.0軟件設計引物與探針，探針的5’端標以熒光發射基團FAM標記，靠近3’端標以熒光淬滅基團TAMRA標記 (表1) 。Forward Primer：5’TAGGCGTCGGTGACAAAGG3’；Reverse Primer：5’GGGTAGCAGACCTCACCTATGTG3’；Probe：5’CACGTAGGCGAACCCTGCCCA3’。

　　1.3 儀器 

　　ABI公司的ABI7500熒光Real－time PCR儀。

　1.4  痰液DNA提取

　　1.4.1  痰液樣品的預處理 

　　吸取待測痰液200μl放入1.5ml的eppendo管中，加入5mol/L NaOH 500μl，混勻，室溫中搖動20min。加入1mol/L NaH2PO4 700μl，混勻(起中和作用)，10 000rmp離心5min。去上清液，補加TE至100μl，混勻，加入20μl濃度為50mg/ml的溶菌酶。置37℃消化30min。

　　1.4.2 DNA的提取 

　　細胞復合裂解液置65℃水浴中，使其中的結晶溶解。將300μl結晶已溶解的細胞復合裂解液加入到上述預處理好的痰液樣品中，混璇器震蕩混勻20秒，置65℃水浴中反應20min。加入200μl蛋白沉淀液，上下顛倒5～6次使兩者混勻。16 000rmp離心3min。將上清液(約500μl)轉移至新的離心管中，加入等體積異丙醇，此時可見透明的絮狀物，混勻后16 000rmp離心3min，傾去上清。加入200μl 70％的乙醇溶液，來回倒置，清洗管壁，16 000rmp離心3min。吸去70％乙醇，倒置離心管于干凈的濾紙上，乙醇揮發完全，加入30μl DNA溶解液，快速漩渦震蕩1～2秒，使沉淀的DNA完全溶解。

　　1.5 標準品的制備 

　　標準品包括：陽性定量參考品、陰性質控品、臨界陽性質控品和強陽性質控品。以結核桿菌陽性DNA樣品2μl做為PCR反應的模板，加入PCR反應液23μl，PCR反應液中含有10x PCR Buffer 3μl、25mmol/L MgCl2 1.2μl、10mmol/L dNTPs 3μl、4U/μl Taq DNA聚合酶0.5μl及10pmol/L上、下游引物各1μl，滅菌雙蒸水13.3μl。于PT-200 PCR擴增儀進行如下循環：先94℃預變性4min；然后94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，30個循環；最后72℃延伸10min。PCR產物經1.5％瓊脂糖電泳，凝膠回收試劑盒回收PCR電泳產物，與線性化后的pMD18-T載體（Invitrogen公司）4℃下連接12～16h，連接反應體系中含有PCR凝膠回收產物3μl、連接緩沖液5μl、線性化后的pMD18-T載體1μl和T4連接酶1μl，連接產物轉化感受態大腸桿菌DH5ɑ，轉化后的細胞涂布于含有氨芐青霉素抗性的1.5％瓊脂固體LB培養基上，37℃倒置培養12～16h，用滅菌牙簽挑取單克隆，接種于含50mg/ml氨芐青霉素的5ml液體LB培養基中，200rpm搖床37℃震搖過夜；取1.6ml過夜培養物，抽提質粒，經PCR初步鑒定，對陽性克隆進行測序分析，將篩選出的陽性菌株進一步擴增，抽提質粒DNA，用核酸蛋白紫外分析儀準確定量(連續測定4次，每次重復4管，取均值)，并進行10倍系列稀釋，得到濃度分別為108、107、106、105copies／ml的4個標準品，即為陽性定量參考品。陰性質控品以生理鹽水制備，強陽性質控品和臨界陽性質控品根據濃度和拷貝數以標準品經滅菌水稀釋后制得。

　　1.6 Taq-man探針實時PCR及反應條件  

　　反應液總體系為20μl，每份反應液中含有2×Probe－PCR Master Mix 10μl，上、下游引物(10μmol/μl)各0.5μl，探針(10μmol/μl)0.2μl，滅菌水6.8μl，結核桿菌陽性DNA樣品2μl。反應條件為: 95℃ 15min(×1) ，94℃ 10s→60℃ 20s →72℃ 30s(×40)。按照上述反應體系及反應條件，隨著PCR體系在每一個循環結束后測定吸光值，就得到了以循環數為橫坐標、吸光值為縱坐標的定量曲線和以標準品濃度的對數值為橫坐標，Ct值為縱坐標的標準曲線。

　　1.7  瓊脂糖凝膠電泳，測序

　　實時PCR產物2％瓊脂糖凝膠電泳，電壓100V，時間1h。ABI3130基因分析儀序列分析。

　　1.8  特異性實驗 

　　分別用陰性痰標本提取物25份和金黃色葡萄球菌DNA提取物、肺炎鏈球菌DNA提取物、肺炎克雷伯桿菌DNA提取物共20份為對照模板進行Taq-man探針進行實時PCR檢測。

　　1.9 檢測限實驗 

　　對陽性樣本以10倍梯度進行稀釋，共5個稀釋度，最大稀釋倍數為10萬倍，然后以各稀釋液為模板進行實時PCR檢測。

　　1.10  重復性實驗 

　　對107標準品重復測定4組10倍倍比稀釋陽性DNA 五次,分別統計其Ct 值。

　　1.11  靈敏度實驗 

　　對102例痰液標本分別進行抗酸染色顯微鏡檢測和實時PCR檢測。

　2  結果

　　2.1  定量曲線 

　　各個稀釋度標準陽性株在第一個循環結束后測到一個基礎吸光值，接下來一直到第20個循環結束時都沒有明顯變化。從第23個循環開始其中的一個反應的吸光值增大，定量曲線開始抬頭，25個循環(Ct 值) 后，曲線迅速上揚，至第36個循環前后達到峰值，隨后進入平臺期，一直到反應結束。陰性對照未出現擴增曲線（圖1）。

　　2.2  瓊脂糖凝膠電泳結果 

　　痰液DNA進行驗證實驗，對所獲取的PCR產物進行測序，序列分析顯示該產物為TB核酸序列。

　　2.3  特異性實驗 

　　葡萄球菌等呼吸道易感菌的DNA提取物為對照模板進行Taq-man探針進行實時PCR未檢測到無熒光信號。

　　2.4  檢測限實驗 

　　對陽性樣本以10倍梯度進行稀釋，然后以各稀釋液為模板進行Taq-man探針進行實時PCR檢測，熒光信號隨樣本濃度下降而下降，線性范圍為103～107copies/ml，檢測下限為102copies/ml。

　　2.5  重復性實驗 

　　重復測定4組10倍倍比稀釋后的標準品，濃度由高到低的Ct 平均值分別是21.07、24.6、28.16、31.57，標準差分別是0.69、0.88、0.39、1.82，變異系數分別是3.9%、4.3% 、1.6%、6.9%，隨著標準品拷貝數的降低，Ct 值增大，標準差和變異系數也呈逐漸增大的趨勢。

　　2.6  靈敏度實驗 

　　對確診肺結核病人102例痰液標本分別進行直接涂片染色法和實時PCR檢測結果對比。直接涂片染色法檢測靈敏度為30％。熒光PCR檢測靈敏度為100％。

3  討論 

　　肺結核的實驗室快速診斷對出入境人員傳染性肺結核的發現有重要的意義，目前，肺結核的實驗室診斷方法主要有細菌學檢查、免疫學檢查和分子生物學檢查。 

　　細菌學檢查是目前傳染性肺結核診斷的金標準，檢測出來的陽性對肺結核的診斷的意義最大，主要有痰涂片抗酸染色直接找分枝桿菌和分枝桿菌培養方法。但是，痰涂片抗酸染直接鏡檢法的陽性率不高，陽性率只有14%～47%，且受痰標本質量的影響，陽性率相差很大［1］。提高痰標本的質量，加強痰涂片鏡檢的質量控制是目前國內外研究的重點［4］。培養方法的陽性率稍高于涂片法，且能得到活菌，但由于結核分枝桿菌的生長速度太慢，檢測的時間長，傳統方法培養需要5～8周時間。BACTEC是采用放射性同位素技術對結核菌進行自動檢測的儀器，使培養分枝桿菌可以把培養時間大大縮短，需9～14d。分枝桿菌生長指示管（MIGT）使用熒光計量技術檢測分枝桿菌的生長，無污染，陽性率高［15,16］，時間短，是快速培養的主流。 

　　實驗室檢測結核分枝桿菌是臨床結核病診斷的主要依據。傳統檢測結核分枝桿菌的主要方法為直接涂片法和培養法［20］，但直接涂片法存在特異性差、靈敏度低和不能鑒別抗酸菌死活的缺點，而培養法則存在特異性差和需時較長的不足［5］，實際臨床應用受限。本實驗中102例標本實時PCR陽性102例(102%)，而直接涂片法只有30例(30%)。實時PCR法與抗酸染色法比較符合率為100%。實時PCR法操作簡便、快速、高效，具有很高的敏感性、特異性，且其在密閉體系中完成擴增并進行實時測定，降低了污染可能性，并可精確地進行定量檢測，為傳染病監測提供參考。實時PCR技術特別對一些含菌量低的標本(如尿液、胸腹水)的檢測具有非常實用的價值，大大提高了結核分枝桿菌的檢出率。實時PCR檢測原理為TaqMan探針法，是在反應體系中加入一個熒光標記探針，探針的5′端標以熒光發射基團FAM， 3′端標以熒光猝滅基團TAMRA。實時PCR過程中，利用Taq酶的5′→3′外切核酸酶活性釋放熒光信號。模板每復制一次，便釋放一個熒光信號，根據熒光強弱可對模板進行準確定量。由于實時PCR采用閉管操作，克服了常規PCR的污染問題，使其具有很高的特異性。實時PCR技術盡管有少數假陽性的結果，但其與常規細菌學方法互補使用可提高陽性檢出率，仍不失為靈敏度高、特異性強的結核病輔助診斷的有效方法之一。 本研究結果顯示， 痰涂片抗酸染色鏡檢陽性率(30%)較低，是可能因為抗酸染色受痰中細菌數量限制，一般至少每毫升痰液含(5×103)～(1×104)個細菌方可得出陽性結果，且結核病人是間斷性排菌，可能造成假陰性。這就要求我們在抗酸染色時要嚴格控制條件，挑取標本中干酪樣或膿性部分，以提高陽性率。而實時PCR檢測法陽性率明顯高于抗酸染色法和改良羅氏培養法，且特異性為100%，這和熒光定量PCR的原理和它所采用的一系列新技術密切相關。尤其是結核病患者經藥物治療或體內出現了細胞壁缺損的L型細菌導致分離培養結果呈陰性時，此方法檢測結果仍不受影響。在本實驗中我們只用陰、陽性來表示結果，但實時PCR可以做到相對定量，且定量結果可以指導臨床用藥和療效評估。實時PCR檢測結核抗酸桿菌DNA每毫升痰中只需少量細菌即可獲得陽性結果 ，并且在本實驗建立過程中，無一例抗酸染色陽性和(或)培養陽性的標本實時PCR檢測為陰性。實時PCR是臨床上廣泛應用的一種基因定量檢測技術，使我們獲得一個從分子水平確定結核的新方法，為結核的快速診斷提供了有力參考