材料
無菌
1. HBSS/PSG: 添加 lOOU/ml 青霉素、3ug/ml 鏈霉素和 25ug/ml 慶大霉素的 HBSS。
2. 消化混合液：含有 150U/ml XI 型膠原酶、40ug/ml dispase 和 1% FBS，用 DMEM 配制。
3. 生長培養液：DMEM，添加 25 mmol/L 葡萄糖、6.8 mmol/L 丙酮酸鹽、0.25U/ml 胰島素、50ng/ml EGF、2.5% FBS 和上述 HBSS 中的抗菌素，在 7.5% CO2 條件下用碳酸氫鈉調整 pH 至 7.4。
4. S-DMEM： 含有 2% 山梨糖醇的生長培養液，過濾滅菌 以上液體應為 37℃ 5. 90 mm Petri 培養皿
6. 普通容器或 30～50 ml 離心管
7. 24 孔培養板，用膠原蛋蛋白預涂：
(a) 稀釋 10X Vitrogen 儲存液；
(b ) 每孔加入 0.5 ml Vitrogen，孵育 3 h；
(c) 吸去多余的 Vitrogen，將培養板放入層流超凈工作臺，風干。
8. 可用保鮮膜（Saran Wrap) 包裹，在 37℃ 條件下保存，于 1 周內使用。
9. 25 cm2 培養瓶
10. 手術刀（4 號刀柄，22 號刀片）
11. Moveue 吸管或類似的大孔徑吸管
二、操作步驟
人結腸隱窩的分離
1. 從病人切除結腸后，盡快將組織放人 DMEM 中。初步研究表明，只要盡快放人 DMEM，結腸組織可在 4℃ 條件下短時間內（2 h) 保存，但不應保存更長時間。
2. 用 1X HBSS/PSG 清洗結腸組織 2 次，以清除污染物。
3. 將結腸組織移入盛有 HBSS/PSG 的干凈 Petri 培養皿。
4. 盡量除去平滑肌，用兩把相對的手術刀將組織切成小塊。
5. 將組織塊移入盛有 20 ml HBSS/PSG 的 25 cm2 培養瓶，通過用 Movette 吸管吹打沖洗組織塊。
6. 讓組織塊沉下，然后吸去 HBSS/PSG。
7. 重復沖洗，直至 HBSS/PSG 清澈。常需重復沖洗 5 次。
8. 將組織塊移入 Petri 培養肌，并吸去多余的 HBSS/PSG。
9. 用手術刀修切組織塊，使組織塊面相當平。用大口徑吸管將組織塊移入 25 cm2培養瓶。須提前用 HBSS/PSG 將吸管內面弄濕，以防組織塊粘貼吸管。
10. 靜置組織塊，然后吸去多余的 HBSS/PSG。
11. 加人 25～30 ml 混合消化液。
12. 在 37℃ 條件下孵育 1 h 。
13. 換混合消化液：
(a) 讓組織沉下。
(b) 輕輕從培養瓶吸去混合消化液，勿吸去未被消化的組織塊。
(c) 加人混合消化液，在 37℃ 條件下繼續孵育 1～2 h 。
(d ) 每 15～30 min 檢查組織 1 次，勿使隱窩過度消化。約 70%～80% 隱窩分離時，消化過程即結束。
其他說明 不要等到全部隱窩被分離，由于過度消化反而導致得到的隱窩減少。
人結腸隱窩的沉降
用山梨糖醇沉降法純化已分離的隱窩。在沉降管頂部可見到較大的脂肪和間質組織的凝集物。由于凝集物會影響沉降，應在開始幾個步驟將凝集物除去。
14. 將培養瓶內消化的組織懸液分人兩只 30 ml 無菌離心管，標為「 Set1」。
15. 在組織懸液上面加 S-DMEM 至 25 ml，然后除去漂浮的脂肪或間質組織。
16. 讓組織懸液靜置 1 min ，以便使未消化的組織沉降。
17. 除去漂在上面的脂性物質，然后輕輕將上層懸液移人兩只離心管，標為「 Set 2」。
18. 讓懸液靜置 30s。
19. 將上層懸液移人兩只離心管，標為「 Set 3」。
20. 在懸液上面加 S-DMEM。
21. 離心（200～300 g，4 min)
22. 吸去上清液。
23. 輕彈離心管底部，使聚集的隱窩分散。
24. 重復用 S-DMEM 混懸隱窩，然后離心。S-DMEM 清洗和離心步驟須重復 5 次左右，直至上清液清澈。
25. 應在顯微鏡下檢查 Set1 和 Set 2 離心管中的沉降組織內是否含有隱窩。如含有隱窩較多，將沉降組織搖勻，從步驟 14 開始重復沉降。如僅含有未消化組織，可將其丟棄。
26. 上清液變清澈時，準備種植隱窩。為了使細胞生長良好，需要合適的種植密度。一般情況下，按每孔（24 孔培養板）800～1000 個/ml 密度種植時隱窩生長最好。按下列方法確定隱窩密度。
(a) 用 10 ml 生長培養液混懸分離的隱窩，然后搖勻。
(b) 取出 100ul，加入 900ul 生長培養液。
(c) 從上液中取 100ul 懸液，計數隱窩。每毫升懸液的隱窩數目 = 計數的隱窩數目 X 100
27. 在 37°C 和 7.5% C02 條件下孵育 2d，讓細胞貼壁。
28. 從培養板吸去含有未附著細胞的培養液，換入新鮮培養液。
29. 每隔 5 天補充 0.5 ml 新鮮培養液。
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