準備和細胞培養
1. 在兩個常規容器中將樣本離心（150 g，10 min )。如果僅用 1 個常規容器收集樣本，在離心前將樣本分到另 1 個常規容器中，以免離心時由于破裂引起樣本丟失的危險。
2. 將滅菌的蓋玻片放入 2 個皮氏培養皿中，用樣本名稱標記蓋和皿。
3. 用吸管吸去上清液，在細胞上面保留 1 ml 液體。
4. 混懸細胞，將細胞懸液移入皮氏培養皿。
5. 每個皿加入 3 ml 培養液，在 38°C、5% CO2 和濕潤的培養箱中培養。
6. 5~7 天后用倒置顯微鏡觀察細胞的生長狀況。
7. 部分更換培養液，即用無菌巴斯德吸管吸去 2 ml 培養液，再加入等量的新鮮培養液。
8. 每周檢査和換液兩次。當大小適中和生長良好的克隆達到足夠數量時，準備收集細胞。收集細胞通常在開始培養后 10~14 天進行。
原位蓋玻片收集法
9. 在采集前，將蓋玻片移入含有培養液的新皮氏培養皿（作適當標記），放置 24 h 。應保留原培養皿，作為多余細胞的儲備來源。
10. 將 0.3 ml 稀釋的秋水仙酰胺加入皮氏培養皿中，使終濃度為 0.1 μg/ml。培養 2~3 h。
11. 用巴斯德吸管輕輕吸去培養液，然后加入 3 ml 預溫至 37°C 的 0.05 mol/L KCl 低滲溶液（0.05 mol/L KCl， 用超純水配制），培養 10 min。
12. 將皮氏皿從培養箱中取出，放在合適的實驗盤上。將標記的皿蓋放在皿的下面。
13. 貼皮氏皿的邊輕輕加入 6 滴固定液，使固定液擴散入低滲溶液，固定 1 min。
14. 再向皮氏皿中加入 6 滴固定液，固定 1 min。
15. 從皮氏皿中吸去 2 ml 上清液后，貼皮氏皿的邊輕輕加入 2 ml 新鮮固定液，固定 2 min。
16. 從皮氏皿中吸去全部上清液，貼皮氏皿的邊輕輕加入 3 ml 新鮮固定液，固定 10 min。
17. 吸去全部固定液后，使蓋玻片在培養皿中晾干。吸去固定液后，將盤的一邊抬高，促使殘留的固定液從蓋玻片上流掉。
用胰蛋白酶進行 G 帶顯帶
18. 在 60°C 烤箱中過夜或在 75°C 熱盤上 2 h，使蓋玻片老化。為了便于識別，將蓋玻片放入皮氏培養皿中。
19. 用生理鹽水配制 0.04 % 胰蛋白酶（用于顯帶，用生理鹽水配制（將 0.4 ml 已配制的 Difco 胰蛋白酶加入 50 ml 生理鹽水中），在顯帶前立即將 1 份 Leishman 染液與 4 份 pH 6.8 緩沖液混合。
20. 用鑷子將蓋玻片放在胰蛋白酶溶液中，輕輕晃動幾秒鐘。應根據蓋玻片老化程度改變胰蛋白酶處理時間。
21. 用緩沖液將蓋玻片浸洗后，放回皮氏培養皿。
22. 立即將稀釋的 Leishman 染液注入皮氏培養皿，根據染料的實際作用染色 2~4 min。
23. 用緩沖液浸洗蓋玻片沖洗后，將其放在吸紙上，并靠在皮氏培養皿上，使蓋玻片上的液體引流掉，讓其晾干。
24. 在封片前檢査蓋玻片的顯帶質量。
25. 用 DPX 將蓋玻片封同于已標記的載玻片上。 展 | 