實驗方法原理 在標準培養箱（37°C ) 中用 Leighton 塑料管培養細胞，然后用胰蛋白酶懸浮法收集細胞。
實驗材料 羊水標本D-PBSA秋水仙酰胺胸腺嘧啶核苷溴脫氧尿核苷胰蛋白酶EDTA Histopaque-l077
試劑、試劑盒 完全培養液胰蛋白酶和EDTA混合液消毒劑如Virkon氯化鉀低滲溶液固定液過氧化氫溶液生理鹽水胰蛋白酶生理鹽水pH6.8的緩沖液Leishman染液
儀器、耗材 普通容器塑料吸管和培養用移液器塑料Leighton管和蓋注射器一次性塑料移液吸管或巴斯德吸管顯微載玻片Copline缸DPX玻片封固劑和蓋玻片烘箱加熱板亮視野相差正置顯微鏡
實驗步驟
試管培養的建立和檢測
1. 將約 10~15 ml 羊水用普通塑料無菌容器送到實驗室。
2. 用帶有無菌塑料混合針的 20 ml 無菌注射器或 10 ml 吸管將樣本分入 3 個 Leighton 管中。按病入和詳細鑒別資料標記試管。如果樣本較少（5 ml 或少于 5 ml )，可用 2 個培養管培養。
3. 離心（150 g，5 min )。
4. 將上清液倒回原來的容器，以供生物化學分析或免疫學分析，例如 α-甲胎蛋白（AFP ) 測定，或者將上清液倒入消毒溶液（Virkon )。
5. 在每個 Leighton 管中用 1 ml 培養液將細胞混懸。
6. 在 37°C 條件下培養 Leighton 管內的細胞。
7. 將細胞靜止培養 5~7 天，使細胞貼壁和建立克隆。
8. 評估細胞生長情況。根據細胞的生長程度，添加 0.5 ml 新鮮培養液或除去培養液后加入約 1 ml 新鮮培養液。
9. 此后，按需要每 2~4 天重新評價細胞的生長狀況，適當更換培養液，直至有足夠細胞收集。通常在培養后 7~12 天收集細胞。如果有可能，在收集細胞的前一天更換培養液。
分散和傳代
10. 將每個培養管加入約 1.5 ml 滅菌的 TE 液，預溫至 37°C 。
11. 從培養管中棄去培養液，然后用 1 ml 滅菌的 TE 液浸洗 1 次。
12. 分散細胞
(a)將 0.2 ml TE 液加入培養管，在 37°C 條件下孵育 1~2 min，使細胞脫落。
(b)用倒置顯微鏡檢査細胞。當細胞懸浮時，加入 1 ml 培養液，然后將培養管放回培養箱。培養液中的血清可終止 TE 液的作用。
13. 傳代
(a)將 0.5 ml TE 液加入培養管，在 37°C 條件下孵育 1~2 min，使細胞脫落。
(b)用倒置顯微鏡檢查細胞。當細胞懸浮時，加入 1.2 ml 培養液，然后將細胞懸液分放入合適數目的繼代培養管。可接種 2~8 個培養管，這取決于最初的細胞密度。使每個傳代培養管中的細胞密度不等，通常是有價值的。這樣，能夠有機會以最佳細胞密度收集培養管內的細胞。
(c)在每個傳代培養管加入新鮮培養液至 1 ml，然后培養。
14. 第 2 天確認細胞已貼壁，然后更換培養液。
培養管內細胞的常規收集
只要備有其他培養細胞，可在原代細胞進行常規收集。如果只保留 1 個培養管，應在收集細胞前繼代培養，或在收集后將細胞傳代。
15. 當準備收集細胞時，將 0.1 ml 稀釋過的秋水仙酰胺（將 1 ml 秋水仙胺酰加人到 9 ml 無菌 D-PBSA 中，作為工作液。然后，每 1 ml 細胞培養液中加入 0.1 ml 工作液，終濃度達到 0.1 μg/ml）加入到每個培養管中。
16. 有必要將細胞培養足夠的時間，以便獲得較多呈圓形的有絲分裂細胞。典型的培養時間為 2~3 h ，但很活躍的細胞可少至半小時，緩慢生長的細胞可達 4 h 以上。
17. 將培養液移入 Virkon 溶液，再將培養管在紙巾上傾流片刻。
18. 加入 2 ml TE 液后，在 37°C 條件下將細胞培養 3 min，以便使細胞脫落。
19. 當細胞懸浮時，加入 7 ml 氯化鉀低滲溶液（0.075 mol/L KCl，用 UPW 配制。將 5.574 g Analair 氯化鉀加入 1 L 超純水中
），在 37°C 條件下將細胞放置 5 min。
20. 離心（150 g，5 min )。
21. 小心地將上清液倒入 Virkon 溶液中，然后將培養管在紙巾上傾流片刻。輕彈培養管，使細胞在剩余的少量培養液中懸浮。
22. 用新鮮固定液（新鮮配制，將 3 份 Analar 甲醇和 1 份 Analar 冰乙酸混合）緩慢固定細胞
(a)輕彈培養管后，滴入 1~2 ml 固定液。不斷搖晃細胞，以免細胞成簇。
(b)加入 3~4 ml 固定液。
23. 離心（150 g，5 min )。
24. 將上清固定液倒入碳酸氫鈉溶液中。
25. 輕輕混懸細胞后，加入 5 ml 固定液。
26. 通過離心、倒掉上清固定液和再固定，更換固定液，即重復操作步驟 9~11。
27. 將細胞離心后，倒掉上清液，用剩余的固定液混懸細胞，制備細胞涂片 (見后述的玻片制備步驟）。