六、CID、ECD和 ETD的對比
基于質譜的蛋白質組學分析依賴于氣相中肽段在低碰撞能量下斷裂, 在質量譜圖中形成峰。進而通過峰圖確定肽段序列，再推斷出相關蛋白質。完成肽段斷裂最主要的方法就是碰撞誘導解離（collision induced dissociation，C I D ) ( S w a n e y et al.， 20 0 8)。 L T Q 、軌道阱(〇rbitraP )、q-T O F 、M A L D I -T O F /T O F 及 F T -I C R 設 備 都 能 完 成 肽 段 的 C I D 斷裂 。 C I D 最適用于小的、低電荷的、未修飾的肽陽離子（p 印tide c a t i o n K D o n g r e et al. ，1996; G o o d e t a L ， 2007; H u a n g etal.， 2005)。 C I D 中轉移到膚段的碰撞能量造成膚段振動激發，并分布到肽鏈中的共價鍵中。如 果 C I D 中轉移到肽段的內部能量超過了鍵斷裂 的 活 化 能 壘 ，肽 段 便 斷 裂 。如 果 這 些 碎 片 在 質 譜 儀 的 時 間 尺 度 內 發 生 ，則 被 檢 測 到 。這種 斷 裂 通 常 發 生 在 肽 鏈 骨 架 的 酰 胺 鍵 上 ，由 于 這 些 位 點 的 活 化 能 壘 較 低 ，便 產 生 了 特 征 性的 b-和 y-產 物 離 子 , 可 在 C I D 譜 中 觀 察 到（S w a n e y et al. ，2008)。
盡 管 C I D 能 夠 有 效 生 成 用 于 肽 段 測 序 的 一 組 離 子 ，但 是 也 存 在 一 些 限 制 從 而 減 弱 了斷 裂 特 定 肽 段 的 能 力 。 內 部 堿 性 殘 基 和 脯 氨 酸 能 夠 阻 止 肽 段 骨 架 的 隨 機 質 子 化 。這 些 殘基 會 將 酰 胺 鍵 的 解 離 轉 換 到 特 定 位 點 , 能 夠 抑 制 肽 段 斷 裂 ，從 而 導 致 測 序 離 子 多 樣 性 不 足(Mikesli et al. ，2006)。胰 酶 作 為 一 種 通 用 蛋 白 水 解 酶 ，通 過 產 生 在 C 端 帶 有 堿 性 殘 基的 肽 段 而 減 輕 了 上 述 問 題 。不 穩 定 的 P T M , 如 磷 酸 化 和 糖 基 化 也 表 現 出 不 同 的 低 能 量 斷裂 途 徑 。在 這 些 情 況 下 ，會 發 生 前 面 提 到 的 中 性 丟 失 事 件 ，導 致 產 生 的 譜 圖 序 列 覆 蓋 性 不足 。一 些 P T M 也 會 抑 制 肽 段 骨 架 的 隨 機 質 子 化 ，進 而 抑 制 經 由 C I D 的 斷 裂 (Tsaprailiset al. ，1999)。
一 種 替 代 的 斷 裂 方 法 稱 為 電 子 捕 獲 解 離（electron-capture dissociation,E C D ) ，能 夠克 服 C I D 的 一 些 局 限 。在 E C D 中 ，質 子 化 的 肽 段 被 F T -I C R 的 潘 寧 阱 (Penning trap)保留 ，并 受 到 一 束 帶 有 熱 能 或 接 近 熱 能 的 電 子 沖 擊 。質 子 化 肽 段 捕 獲 熱 電 子 后 會 導 致 骨 架斷 裂 ，而 分 子 內 振 動 能 并 未 重 新 分 布（Udeshi et al. ，2007)。 圖 4 0 . 4 中 描 述 了 一 種 解 釋浸 人 熱 電 子 的 肽 段 斷 裂 過 程 的 方 式 。 E C D 斷 裂 通 常 產 生 c-和Z-離 子 系 列 ，而 C I D 則 產 生b-和 y-離 子 。 E C D 是 與 分 子 大 小 和 序 列 無 關 的 過 程 ，可 以 用 來 斷 裂 完 整 蛋 白 質 。然 而 ，對 于 有 效 的 E C D ，樣 品 必 須 處 于 高 密 度 的 熱 電 子 中 。這 種 環 境 對 于 利 用 靜 電 射 頻 場 分 離離 子 的 設 備 ，在 技 術 上 較 難 實 現 , 但 是 在 使 用 靜 磁 場 的 F T -I C R 中 比 較 容 易 。另 外 ，用 于測 序 的 E C D 需 要 在 數 分 鐘 內 進 行 大 量 掃 描 ，并 取 平 均 值 。這 需 要 的 樣 品 量 較 大 ，且 對 復雜 樣 品 混 合 物 中 的 蛋 白 質 和 多 肽 的 檢 測 不 利 。
E T D 使 用 多 環 芳 香 烴 類 的 離 子 化 自 由 基 負 離 子 ，與 氣 相 中 多 質 子 化 肽 段 反 應 。這些自 由 基 負 離 子 在 質 譜 的 線 性 四 極 桿 離 子 阱 中 儲 存 。 自 由 基 負 離 子 轉 移 一 個 電 子 到 離 子 化的 肽 段 上 ，誘 發 電 荷 減 少 的 肽 段 以 E C D 類 似 的 機 制 斷 裂 ，產 生 特 征 性 的 c-和z-序 列 離 子(Syka et d . ，2004)。 E C D 和 E T D 的 斷 裂 模 式 與 肽 段 長 度 、氨 基 酸 組 成 和 P T M 的 存 在與 否 均 無 關 (U d e s h i e t a l ., 2007)。這 一 斷 裂 過 程 非 常 高 效 , 并 能 在 毫 秒 內 完 成 。 因 此 ，E T D 的 靈 敏 度 高 至 可 測 量 飛 摩 爾 級 的 樣 品 量 , 發 生 的 時 間 尺 度 與 目 前 的 色 譜 分 離 技 術 一致 (Sykaet a L ，2004)。該 斷 裂 技 術 的 主 要 優 勢 在 于 , 它 能 夠 保 持 不 穩 定 的 P T M , 同時允許 足 夠 的 酰 胺 鍵 斷 裂 ，從 而 產 生 能 夠 獲 得 測 序 信 息 的 譜 圖 。然 而 ，這 一 方 法 存 在 由 于 前 體離 子 電 荷 減 小 而 導 致 碎 片 離 子 產 量 降 低 的 問 題 。
近 期 一 項 研 究 使 用 了 E T D 和 C I D 混 合 方 法 (E T c a D ) ，通 過 C I D 來 靶 向 E T D 未解離的 電 子 轉 移 產 物 離 子 。 E T c a D 的 序 列 覆 蓋 度 中 位 值 為 88. 9 % ，而 單 獨 使 用 E T D 僅 為62.5 % ，C I D 為 77. 4 % ( S w a n e y et al. ，2007)。其 他 一 些 研 究 利 用 E T D 鑒 定 P T M J n鱗 酸 化 修 飾 。一 個 研 究 組 使 用 基 于 C I D 斷 裂 方 法 鑒 定 了 1 0 0 0 個 以 上 的 磷 酸 肽 , 但 是 僅能 鑒 定 3 8 3 個 磷 酸 化 位 點 ，這 主 要 是 由 于 修 飾 肽 段 的 中 性 丟 失 (Udeshi etal. ，2007)。使用 E T D 改 良 的 L T Q , 可 以 鑒 定 一 個 復 雜 混 合 物 中 6 2 9 個 蛋 白 質 的 1 2 5 2 個 磷 酸 化 位 點 。另 一 項 對 E T D 和 C I D 鑒 定 的 磷 酸 肽 重 疊 分 析 發 現 ，兩 種 方 法 產 生 的 兩 個 數 據 集 中 僅 有17.9 % 相 同 ( S w a n e y et al. , 2008)。這 說 明 斷 裂 并 鑒 定 P T M 位 點 的 最 好 方 法 ，也 許 就 是將 C I D 和 E T D 結 合 起 來 。圖 40. 5 展 示 了 用 兩 種 斷 裂 方 法 產 生 的 典 型 譜 圖 。在 C I D 中出 現 了 特 有 的 b-和 y-離 子 , 而 E T D 產 生 了 特 有 的 c- 和 z-離 子 。
七、P T M 的定量分析
當研究 P T M 的生物學意義時，如能了解一個特定修飾或一組P T M 的相對或絕對豐度通常會有幫助。這樣可以將不同的生物樣品間的目的修飾進行直接比較。例如, 將正常與疾病狀態下細胞或組織內某一 P T M 的豐度進行比較。定量分析這些變化能夠幫助深人了解 P T M 在細胞生長、疾病和凋亡等無數過程中扮演的角色。許多方法可以量化P T M ，傳統方法使用2I> G E 和鑒別染色法來鑒定樣品中蛋白質表達水平的差異。然 而 ，這個方法分辨率低，并且可能會由于一些蛋白質染色能力的不同而導致產生假象（O n gand M a n n ， 2005)。 2D ——G E 是最適宜用來分析蛋白質豐度的方法 ( A n d e r s o n and A n d e r -s o n, 1998)。就在最近, 基于質譜的方法減輕了基于凝膠的方法帶來的問題。基于質譜的方法包括蛋白質或肽段標記策略、標簽手段以及利用譜圖計算的差異蛋白質組學法(Gygi et al. ， 1999; O n g et a L ， 2002; W a s h b u m et al.， 2001)。盡管這些方法更廣泛應用于樣品中蛋白質變化的定量分析，但是也可以用來定量分析不同生物樣品中 P T M 的變化。
定量分析既可以是絕對的, 如濃度或每個細胞拷貝數，也可以是相對地，如不同處理的樣品中倍數變化。絕對濃度更加難以獲得，但是更有利于分析，并且可以用來衍生相對測量 。 L C -M S /M S 實驗中，隨著肽段依次從色譜柱上洗脫下來，可繪制肽段信號強度圖譜 。對于任何給定的組分，曲線下的面積都與肽段的豐度直接相關，可以進行無標記 (label-free)的量化。然而，肽段的理化性質 ，如疏水性、電荷和大小 , 變化范圍非常廣 , 這會引起質譜檢測器響應的差異。另外，當采用這種無標記方法進行定量分析時，洗脫條件的變化及其他非目的肽段的共同洗脫都會成為問題。使用這個方法測定蛋白質豐度可能與實際豐度相差 3?5 倍 ( O n g and M a n n , 2005)。
為避免電離效率和 M S-檢測器響應相關的問題，可以利用基于穩定同位素稀釋理論(stable isotope dilution theory)的方法。這一理論認為，一個穩定的、同位素標記的肽段與其天然類似物化學性質相同。因此，同位素標記和未標記的肽段, 在色譜和 M S 檢測中行為一致。由于質譜能夠識別標記和未標記形式間的質量差異，因此可以檢測相對的信號強(Bantscheff etal. ， 2007)。利用穩定同位素稀釋理論的策略主要有 4 種 。第 一 ，與 目 的 P T M 相應的同位素標記肽段標準物可以引入到樣品中（Gerber et al, , 2003)。第 二 ，細胞在含主要同位素化純組分的培養基中生長，可以被代謝標記 ( O n g and M a n n ,2005)。第三，在使用蛋白酶，如胰酶水解過程中，同位素可以被整合到肽段中（Miyagiand R a o , 2007)。第四 ，可以通過化學方法將同位素標記的標簽連接到特定氨基酸側鏈上 (Gygi et al. ， 1999; Ross et al. ， 20〇 4)。不管選擇什么方法，肽段的「重」「輕」形式之間質量差異應最小為 3?4 D a , 以避免質譜圖中峰的同位素重疊。另外，氣化肽段與其「輕」的類似物相比，色譜洗脫時間有所不同（Z h a n g and Regnier， 2002)。這導致需使用更加昂貴的 13C -和 15N -試劑。
運用穩定同位素的最基本的方法稱為絕對定量法（absolute quantitation，A Q U A )(Gerber et a l.， 2003)。 在這一方法中，將合成的同位素標記肽段作為內標加人到肽段混合物中。 Steve G y g i 和同事利用這個方法確定了非洲爪蟾 (X e n o p w s ) 細胞周期中磷酸化的豐度變化( S t e m m a n n et al. ， 2001)。這 個 方 法 需 要 為 每 個 量 化 的 P T M 標記合成肽段 ，因此比較麻煩。標記的磷酸肽內標物易于獲得，但并不是所有的修飾都這么簡單，這限制了這個方法的廣泛應用。內標物通常在蛋白質水解的前后加入, 這樣無法標準化消化步驟上游的樣品制備時出現的變化。這 一 方 法 還 需 要 對 P T M 有 事 先 了 解 ，從而能夠合成相應肽段。也有必要了解修飾肽段的大體豐度，從而能夠加人近似量的標記標準物。
為最小化樣品制備的誤差，細胞可以在不同條件 (含同位素標記或不含同位素標記）下培養，并且在樣品制備和分析之前收集細胞。樣品制備時的任何誤差都會對兩種細胞群產生同樣的影響。 Mathias M a n n 的實驗室發展了這些方法中最流行的技術，稱為細胞培養氨基酸穩定同位素標記（stable isotope labeling by amino acid in cell culture,SIL A C ) ( O n g et al., 2002)。在 S I L A C 方法中，培養基中含 13C 6-精氨酸和 13C s-賴氨酸，它們能夠標記胰酶酶切位點。因此除去 C 端碎片，每個胰蛋白酶酶切產物都包含一個標記的氨基酸。 S I L A C 法與完全代謝標記法相比優點在于, 整合的標記數是確定的，并且獨立于氨基酸序列。這種簡易性使得 S I L A C 的數據翻譯比使用其他更復雜的標記方法簡單 。 S I L A C 最多只能比較 3 個培養條件，分別是未標記、13C ,-標記或 13C 615N 4-標記氨基酸 。 S I L A C 的其他局限性在于它只能用于特定的模式生物，或者是能夠在含有確定同位素成分的培養基中生長的細胞系，并且非常昂貴。然 而 S I L A C 的高準確度使得該方法非常適合于研究 P T M (G)Isen et al.， 2006)。一個改進的 S I L A C 法利用標記的 S -腺苷甲硫氨酸進行標記，來鑒定并相對定量蛋白質甲基化修飾 (()ng et al. ， 2004)。
一種體內代謝標記法的替代方法是體外酶標記法。這種標記方法既可以在蛋白質消化過程中完成，也可以在蛋白質水解后通過額外反應步驟完成。當使用重水（H 218O )時 ，胰蛋白酶或 Glu-C 將會引入兩個 18O 原子。生 成 的 4 D a 漂移足以使同位素被分辨，并獲得相對定量數據 (Miyagi and R a o ， 2007)。然而，一些蛋白酶，如蛋白內切酶 L y t N ，僅引入一個 18O 原子，產生的譜不足以分辨同位素峰重疊 (Raoet al., 2005)。完全酶標記很難達到 ，并且不同肽段引人標記的速率不同，使得數據分析變得復雜 (Ramos-Femandez et al. ，2007)。所以此方法在定量蛋白質組學中沒有得到廣泛應用 ( O n g e t al.， 2004)。
有效的化學標簽（chemical tagging) 技術能減輕酶標簽方法的某些限制。最早的化學標簽法是由 Ruedi Aebe r s o l d 實驗室發展的，稱為同位素編碼親和標簽（isotope-codedaffinity tag,I C A T )(G y g 丨 e t a L ， 1999) s I C A T 試劑最初由以下成分組成: 一個靶向半胱氨酸的硫醇反應基團、帶 有 〇或 8 個氣原子的一個聚醚連接區 (linker region) 以及為親和素柱親和純化準備的生物素基團。由于氘同位素與其輕形式相比在色譜柱中的行為不同，因此發展了 13C 和 15N附加標簽試劑 (Bottari etal. ， 2004)。 I C A T 反應在還原環境下進行，利用重或輕 I C A T 試劑將樣品化學標記。然后 ，這兩個樣品混合，并選擇一種蛋白酶將其水解。標記的肽段通過 I C A T 組分的親和標簽回收, 并用質譜定量分析。這一方法僅選擇含有半胱氨酸的肽段，因此有效簡化了肽段混合物。然而大部分肽段不含半胱氨酸殘基，并且大部分 P T M 在親和純化步驟中被丟棄，因 此 I C A T 并沒有廣泛應用于P T M 定量分析(Bottari et al.， 2004)。
另外一類化學標簽策略是利用肽段 N 端和賴氨酸殘基的 e?氨基的反應活性。同位素編碼蛋白標記法(I C P L )、相對和絕對定量同位素標簽法（isot0p e tag for relative andabsolute quantification，i T R A Q ) 及串聯質量標簽法（tand e m m a s s ta g ， T M T ) 都是利用了氨基與特定化學基團的反應活性 (Bottarietal.， 2004)。這些方法中最受公認的技術為 i T R A Q , 其引人了等量異位（isobaric tag) 標簽, 能夠在串聯質譜儀中斷裂，在 113?121m/z值處產生了獨特的報告離子 ( O n g et al, , 2004)。通過對這些低質量碎片的峰面積進行積分來定量。具備檢測低 m /z 碎片離子能力的質譜儀，如 四 極 桿 和 T O F , 通常都可 用 于 i T R A Q 實驗。商業化試劑盒允許一個實驗檢測 8 種狀態。由于肽段的標記是等量的 ，因 此 它 們 在 色 譜 分 離 中 性 質 類 似 ，并 且 在 碎 片 圖 譜 中 顯 示 出 定 量 差 異 。通過i T R A Q 方法，不同樣品在不同條件下分離，經胰酶消化后，利 用 i T R A Q 試劑進行標記。隨后樣品混合，并通過一個 M S /M S 實驗進行分析。圖 40. 6 展 示 了 一 個 經 4 種 i T R A Q試劑標記后，按不問比例混合而得到的串聯質譜圖的例子 (Ross et al. ，2004)。至于其他基于質譜的方法，有效的肽段分離非常重要，因為共同洗脫下來的相近質量的肽段也會對觀測到的報告離子作出貢獻，從而干擾定量分析。離子阱質譜法通常不適用于 i T R A Q分析，因為得到的 M S /M S 數據中，i T R A Q 標簽碎片產生的報告離子中的較小的 1/3 會丟失。利用脈沖 q 解離 (pulsed q-dissociation，P Q D )可緩解該問題，但是后者在蛋白質組學中應用有限（Bantscheff et al.， 2008; Cunningham et al.， 2006; Griffin et al.， 2007)。
利 用 i T R A Q 方 法 可 以 比 較 不 同 條 件 下 蛋 白 質 組 的 磷 酸 化 水 平 。 Forest W h i t e 和同事 研 究 利 用 抗 磷 酸 化 抗 體 后 接 I M A C 富 集 ，進 而 i T R A Q 標 記 的 方 法 研 究 表 皮 生 長 因 子(E G F ) 刺 激 隨 著 時 間 對 細 胞 磷 酸 化 狀 態 的 影 響（Z h a n g etal. ，2005)。這 項 研 究 在 一 次分 析 中 調 査 了 4 個時間點 (0min 、5min 、10min、30mim)。他 們 能 夠 量 化 58 個 蛋 白 質 的 78個 位 點 的 磷 酸 化 相 對 變 化 ( Z h a n g et al., 2005)。這 項 實 驗 方 法 強 調 了 將 P T M 富 集 與 定量 相 結 合 的 功效 ，能 夠 更 加 深 入 地 了 解 細 胞 的 生 物 學 。但 是 很 難 確 定 在 某 一 特 定 條 件 下一 組 肽 段 中 哪 些 發 生 了 磷 酸 化 ，這 是 因 為 未 磷 酸 化 肽 段 與 磷 酸 化 肽 段 在 質 譜 檢 測 響 應 中有 差 異 。因 此 , 盡 管 可 以 在 不 同 條 件 下 ，將 未 修 飾 形 式 之 間 進 行 比 較 ，或 者 將 相 同 肽 段 的不 同 磷 酸 化 水 平 進 行 比 較 ，但 是 通 過 生 成 譜 的 報 告 離 子 峰 的 比 值 來 比 較 修 飾 與 未 修 飾 形式 并 不 可 靠 。
目前發展了有限數量的專門鑒定特定 F T M 的附加標簽的方法。這些方法利用了化學修飾的氨基酸側鏈選擇性的化學反應。為了定量分析磷酸化修飾, 磷 酸 的 消 除 以 及隨后的乙二硫醇衍生物的 M i c h a e l加成都可用來引人同位素標簽 ( Z h a n g et aL ， 2003)。阱化學法也可應用于糖基化的肽段, 用同位素標記的標簽替換碳水化合物基團。但這些方法僅對少數 P T M 有效。除此之外，如果參與的化學反應并不高效，生成的多肽混合物的復雜程度將會增加。這會導致肽段和相應 P T M 的鑒定出現問題, 也會出現不準確的量化信息。
同位素標記和標簽策略可能耗時、繁瑣并且成本較高。除了先前討論的色譜峰積分法 ，也有其他一些無標記定量方法可以用來定量分析 P T M 。這些方法通常會涉及一些形式的譜圖計數 (spectral counting)和蛋白質長度的標準化（W a s h b u r n et al. ， 2001)。它們是否真正能夠進行定量分析仍存在爭議, 因此這些方法更普遍作為差異蛋白質組學技術 。譜圖計數方法的理論基礎是，隨著給定樣品中某一蛋白質豐度的增加, 能分離出更多來源于該蛋白質的肽段 M S /M S 譜 。通過比較實驗組間收集的某一特定蛋白質的譜圖的數量可推斷出相對的定量分析。這一方法的使用被質疑是由于它并沒有直接測量肽段的任何物理性質，并且假定每個蛋白質都發生線性反應 ( B a n t s c h e f f e t a U 2007)。正如前面提到的，肽段的理化性質在一個消化樣品中變化范圍非常廣，以至于它們在色譜和 M S檢測器的行為也大有不同。與標記和標簽技術相比，這些方法提供了更大的動態范圍，最適用于研究樣品中大的或球狀蛋白質的變化。然 而 ，肽段中不確定線性反應和譜圖計數的潛在低準確度都限制了這些方法的廣泛應用(Old et al.， 2005)。
為了將樣品中蛋白質無標記定量分析的變異性最小化, 可以比較多個樣品中相同蛋白質的特定肽段或多種肽段。這 推 動 / 選擇性反應監測（selected reaction monitoring，S R M )和 P T M 的多重反應監測 (multiple reaction monitoring,M R M ) 技術的發展 ( U n w i net al.， 2005， 2009; Williamson et a L ， 2006; Wolf-Yadlin et al. ， 2007)。在一個 S R M實驗中，多個實驗組中的單一肽段前體及其碎片離子 m 八值或瞬態 (transition) 被選擇性監 測 ，通常使用三重四極桿質譜 (Lange etal.， 2008)。要使蛋白質的量化具有較高的統計置信度，通常 在 M R M 實驗中檢測 3?5 肽段及其瞬態。這些實驗一般使用三重四極桿質 譜 ，因四極桿的第一個和第三個四極桿在分離特定的瞬態時具有高分辨率和高占空比(high duty cycle)。多重瞬態被監測, 隨著時間每個特定瞬態都產生一組關于滯留時間和信號強度的譜圖。瞬態的積分區域用來定量分析蛋白質。 M R M 能夠實現對復雜混合物中低豐度蛋白質的檢測，并在高達 5 個數量級的動態范圍內產生線性響應 (Lange et al.， 2008)。
雖 然 M R M 可以用來選擇性監測包含 P T M 的蛋白質(Williamson et al.， 2006)，然而 ，M R M 缺少鑒定混合物中蛋白質的能力，并且瞬態的選擇通常是基于先前的實驗數據或文獻搜索。瞬態還必須進行優化, 以便能在三重四極桿中的第二個發生有效斷裂。盡管計算工具可能會有所幫助, 但是研究還是可能因樣品有限而受到限制。另外，三重四極桿 利 用 C I D 斷裂肽段，因此不穩定P T M 可能會發生中性丟失。
M R M 的擴展應用包括使用同位素標記的合成肽(過程類似于 A Q U A )來完成肽段絕對定量分析(W o l f-Y a d l i n e t a l., 2007)。總之, 這種質譜中新出現的技術非常有潛力，能夠為多種生物樣品提供蛋白質和 P T M 的定量分析信息。
