耐藥質粒 DNA轉化實驗
本實驗學習將質粒DNA分子轉入大腸桿菌的方法及如何篩選帶有質粒DNA的細胞克隆，即轉化子。
【原理】
受體菌Ecoli RRI 在低溫條件下經Ca++ 處理，可改變細胞膜的通透性，利于受體菌對DNA的攝取，這種經Ca++ 處理的細菌稱感受態菌。pBR322 質粒帶有氨基芐青霉素（Ap）和四環素（Tc）基因，如將pBR322質粒轉入到對上述抗生素敏感的Ecoli RRI菌體內，則可使該細菌獲得Apr和Tcr，表現出對Ap和Tc的抗藥性。
（一）感受態菌的制備
【材料】
1．菌株 E.coli RRI
2．LB 液體培養基
3．75mM Cacl2
4．其它：滅菌小試管、刻度吸管、微量加樣器、離心機
【方法】
1．將細菌接種于5ml LB液體培養基中，37℃振蕩培養16~20h。
2．取新鮮菌液，按1/100的接種量接種于LB培養基中，37℃振蕩培養2~3h。
3．取1.5ml菌液，4℃ 3000rpm/min,離心5min，棄上清。
4．菌體沉淀加入750μl預冷的（4℃）75mmol/L CaCL2 溶液，輕輕吹打菌懸液，放冰浴30min。
5．4℃3000rpm/min,離心5min，棄上清。
6．菌體沉淀加入200微升預冷的75mmol/LCaCL2溶液，冰浴4min以上。4℃保存備用。
（二）質粒轉化
【材料】
1．pBR322 質粒DNA,
2．感受態菌75mmol CaCl2
3．LB肉湯培養基，無藥LB瓊脂平板，氨芐青霉素瓊脂平板（50ug/ml）
4．其它：滅菌小試管，L形玻璃棒
【方法】
1. 取2個潔凈，滅菌的EP管，按表10－2加入各成分：
2. 上述2個試管充分混均勻后，置冰浴30min。
3. 42℃2min或37℃5min，立即置冰浴2min。
4. 加入1ml LB肉湯培養基，37℃靜止培養1h。
（三）轉化子篩選：
1．取實驗組培養菌液涂布在氨芐青霉素瓊脂平板（50ug/ml）上，對照組菌液分別涂布在無藥LB瓊脂平板和氨芐青霉素瓊脂平板上，每塊板涂0.1ml，用滅菌L形玻璃棒涂勻。將涂好的平板置370C培養過夜，觀察轉化結果。
2．E.coli 受體菌不含有質粒DNA，也不含Apr和Tcr 。在含Ap和Tc的培養基中不能生長,若實驗組在含Ap和Tc的平板上出現菌落，可初步確定受體菌獲得了耐藥性質粒，然后再通過提取質粒DNA進一步鑒定轉化子。