磷酸鈣法轉染HEK293T細胞

293T細胞

無菌水ddw NaCl KCl Na2HPO4 glucose HEPES CaCl2

Eppendorf管 培養皿 培養箱

1. 鋪細胞： 選擇狀態良好的293T細胞傳代， 2-3x10⁵個細胞/35mm dish。

2. 20-24h后，待細胞長至鋪滿瓶底約50-70%的時候，進行轉染。下面就35mm dish為例，采用以下轉染體系：

ddw： 105ul

plasmid： 2ug （如0.5ug/ul， 即用4ul）

2M CaCl2： 16.5ul

2XHBS： 125ul

按上述順序，往eppendorf管中依次加入上述四種試劑。

先將前三者混勻， 最后加2XHBS。

一種方法是，加2XHBS時要逐滴加入， 吹打至微現乳白色， 立即均勻滴入培養皿，輕輕搖勻后置于培養箱中，6-8h后換液。

另一種方法是， 加入2XHBS后立即吹打約40下（不過這個要根據每個人的力道和吹打的頻率而定， 建議做一個梯度實驗，吹打不同的次數看哪次的轉染效率高以后就按這個次數來吹打）， 之后步驟同上， 立即均勻滴入培養皿，輕輕搖勻后置于培養箱中，6-8h后換液。

1.HBSP 緩沖液的 pH 值在 6 .70 和 7 .10 時轉染HEK 293T 細胞的效果不好 ,細胞成活率低， 有大顆粒狀物體存在;pH 值在 6 .96 時轉染效果好，細胞存活率高， 藍染細胞明顯。

2.未純化的 lacZ-pShuttle 質粒轉染 HEK 293T 細胞轉染效率低， 細胞成活率很低，而純化后的質粒轉染效率高 ,藍染細胞明顯 。

1.轉染后培養 6h 進行甘油休克效果最佳，比培養 0h 直接進行休克轉染效率升高584.4 %。

2.甘油休克時間為4.5min 時轉染效果最佳，比不用甘油休克轉染效率升高 130.8 %。

3.來源于論文《一種用磷酸鈣法高效轉染 HEK 293T 細胞方法的建立》,陳曉,蔣捍東,路新枝,于文功。