在蛋白質的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中，蛋白質能夠保持完整狀態，并依據蛋白質的分子量大小、蛋白質的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開；在DNA的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中，DNA呈雙鏈狀態泳動，其遷移率會受堿基組成和序列的影響。
在變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中，由于加入了變性劑——蛋白質變性劑常為SDS（SDS-PAGE），核酸變性劑常為尿素、甲酰胺等，故其分離僅依據于分子量大小。蛋白質的SDS-PAGE技術最初由shapiro于1967年建立，他們發現在樣品介質和丙烯酰胺凝膠中加入離子表面活性劑和強還原劑（SDS，即十二烷基硫酸鈉）后，蛋白質亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小（可以忽略電荷因素）。SDS是陰離子去表面活性劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級結構。而強還原劑如巰基乙醇，二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側鏈和SDS結合成蛋白- SDS膠束，所帶的負電荷大大超過了蛋白原有的電荷量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結構差異。
SDS-PAGE一般采用的是不連續緩沖系統，與連續緩沖系統相比，能夠有較高的分辨率。
濃縮膠的作用是有堆積作用，凝膠濃度較小，孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個狹窄的區帶。當樣品液和濃縮膠選TRIS/HCl緩沖液，電極液選TRIS/甘氨酸。電泳開始后，HCl解離成氯離子，甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質帶負電荷，因此一起向正極移動，其中氯離子最快，甘氨酸根離子最慢，蛋白居中。電泳開始時氯離子泳動率最大，超過蛋白，因此在后面形成低電導區，而電場強度與低電導區成反比，因而產生較高的電場強度，使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動，形成一穩定的界面，使蛋白聚集在移動界面附近，濃縮成一中間層。
此鑒定方法中，蛋白質的遷移率主要取決于它的相對分子質量，而與所帶電荷和分子形狀無關。