聚丙烯酰胺凝膠電泳法

1.儀器裝置通常由穩流電泳儀和圓盤或平板電泳槽組成。其電泳室有上、下兩槽,每個槽中都有固定的鉑電極，鉑電極經隔離電線接于電泳儀穩流擋上。

2.試劑 (1)溶液A 取三羥甲基氨基甲烷36.6g，四甲基乙二胺0.23ml,加0.1mol/L鹽酸溶液48ml，再加水溶解并稀釋至100ml,置棕色瓶內，在冰箱中保存。 (2)溶液B 取丙烯酰胺30.0g、次甲基雙丙烯酰胺0.74g，加水溶解并稀釋至100ml,濾過，置棕色瓶內，在冰箱中保存。 (3)電極緩沖液(pH8.3) 取三羥甲基氨基甲烷6g、甘氨酸28.8g,加水溶解并稀釋至1000ml，置冰箱中保存，用前稀釋10倍。 (4)溴酚藍指示液 取溴酚藍0.1g,加0.05mol/L氫氧化鈉溶液3.0ml與90％乙醇5ml,微熱使溶解，加20％乙醇制成250ml。 (5)染色液 取0.25％(W/V)考馬斯亮藍G<[250]>溶液2.5ml，加12.5％(W/V)三氯醋酸溶液至10ml。 (6)稀染色液 取上述染色液2ml，加12.5％(W/V)三氯醋酸溶液至10ml。 (7)脫色液 7％醋酸溶液。

3.操作法 (1)制膠 取溶液A2ml，溶液B5.4ml，加尿素2.9g使溶解，再加水4ml，混勻，抽氣趕去溶液中氣泡，加0.56％過硫酸銨溶液2ml，混勻制成膠液，立即用裝有長針頭的注射器或細滴管將膠液沿管壁加至底端有橡皮塞的小玻璃管(10×0.5cm)中,使膠層高度達6～7cm, 然后徐徐滴加水少量，使覆蓋膠面，管底氣泡必須趕走，靜置約30分鐘，待出現明顯界面時即聚合完畢，吸去水層。 (2)標準品溶液及供試品溶液的制備照各藥品項下的規定。 (3)電泳將已制好的凝膠玻璃管裝入圓盤電泳槽內，每管加供試品或標準品溶液50～100μl，為防止擴散可加甘油或40％蔗糖溶液1～2滴及0.04％溴酚藍指示液1滴,也可直接在上槽緩沖液中加0.04％溴酚藍指示液數滴，玻璃管的上部用電極緩沖液充滿，上端接負極、下端接正極。調節起始電流使每管為1mA，數分鐘后，加大電流使每管為2～3mA，當溴酚藍指示液移至距玻璃管底部1cm處，關閉電源。 (4)染色和脫色電泳完畢，用裝有長針頭并吸滿水的注射器,自膠管底部沿膠管壁將水壓入，膠條即從管內滑出，將膠條浸入稀染色液過夜或用染色液浸泡10～30分鐘，以水漂洗干凈，再用脫色液脫色至無蛋白區帶凝膠的底色透明為止。 (5)結果判斷將膠條置燈下觀察，根據供試品與標準品的色帶位置和色澤深淺程度進行判斷。相對遷移率供試品和標準品的電泳區帶有時可用相對遷移率(R'<[m]>)進行比較。其計算式如下：進膠端到供試品或標準品區帶的距離相對遷移率(R'<[m]>)＝──

進膠端到溴酚藍區帶的距離掃描將清晰的膠條置雙波長薄層掃描儀或凝膠電泳掃描儀中掃描并積分，由各組分的峰面積計算百分含量。