| 實驗步驟 |
材料
緩沖液和溶液
稀釋緩存液至適當濃度。
建議使用無菌的過濾水（Milli-Q 或相當級)。
乙腈
毎個 Sep-PakC18 柱用 10 ml 高效液相（HPLC) 級乙腈。
乙酸銨（10mol/L)
每個 Sep-PakC18 柱用 2 ml 10 mmol/L 乙酸銨溶液。
正丁醇
不含指示染料的甲酰胺凝膠加樣緩沖液
凝膠加樣緩沖液含有未烯釋的甲酰胺，不含指示染料
[溴酚蘭和（或）二甲苯藍]。凝膠加祥緩沖液中不加指示染料，染料或染料中的污染物可以與寡梭苷酸以相同的速率移動，而干擾通過紫外光吸收對樣品的檢測
(見步驟 14)。如需要，可在凝膠加樣緩沖液中加 0.2% 的橙紅 G, 該染料遷移至加樣緩沖液的前沿，不會影響寡核苷黢的檢測。
甲酰胺指示染料混合液
此溶液為甲酰胺與指示染料的水溶液（0.05% 二甲苯藍和 0.05% 溴酚蘭）的 50:50 混合液。可將其加到寡核苷酸樣品相鄰的加樣孔作為分子質量標準。
甲醇：水溶液
將 6 ml 甲酵與 4 ml 過濾無菌水（Milli-Q 級）混合，每個 Sep-Pak C18 柱用 3 ml 甲醇：水溶液。
寡核苷酸洗脫緩沖液
0.5mol/L 乙酸銨
10 mmol/L 乙酸鐵
有些研究者在寡核苷酸洗脫緩沖液中加入 0.1%（m/V)SDS。如杲用 Sep-Pak Cl8 柱層析純化寡核苷酸、本方案不推薦使用 SDS(見步驟 16 的注解)。
TE 溶液（pH8.0)
核酸與寡核苷酸
合成寡核苷酸粗制品
合成寡核苷酸通常由廠商提供，為已除去合成反應的保護基的凍干品（見信息欄「寡核苷酸合成」)。
脫保護一般包括將制品在 NH4OH 濃溶液中 55°C 下保溫約 5 h。[一些新的 DNA 合成方案對一種或幾種核苷使用不同的保護基（如乙酰化保護的 dC), 能在 10min 內除去]。
寡孩苷酸純化前，應確定已經過脫保護反應。如提供的寡核背酸是在 NH4OH 中，可將 0.5~1.0 ml 液體轉移到 1.5 ml 微量離心管，用離心干燥機（SavantSpeed Vac 或類似產品）室溫揮發干燥。
當第一次打開一個粗制寡核苷酸時，應緩慢打開管蓋，讓氨氣揮發（放在化學通風柜中更好)，這樣可減少寡核苷酸噴酒到房間周圍的機會。
專用設備
MillexHV 濾器（Millipore,0.45nm 孔徑）
石蠟封口膜或熒光薄層層析板
層析板可從美國 Erinkmann 公司或歐洲 E.Merck 公司購買、如 Merck 硅膠 20 cmX20 cm 板。
Sep-Pak 傳統層析柱，短柱身
Sep-Pak 傳統層析柱（可從 Millipore 公司的 Waters 部門購買）含有 360 mg/柱的疏水（C18) 反相層析樹脂。純化是利用核苷酸在極性較髙的溶劑（水溶液）中與樹脂結合，而當溶劑（如甲醇與水混合液）的極性降低時洗脫的原理。窠丙烯酰胺凝膠中每 10OD160 寡核苷酸需一個層析柱。
注射器（5 ml 和 10 ml, 聚丙稀）
每個寡核苷酸樣品需一個 5 ml 和一個 10 ml 注射器。
紫外燈（260nm, 手提式）
水浴或預設 55°C 加熱器
附加試劑
步驟 7~9 所需試劑列于第 12章方案 8 和 11。
方法
寡核苷酸粗樣品的凝膠電泳準備
1. 無菌微量離心管中，用無菌過濾水（Milli-Q 或相當級）配成 10umol/L 的粗寡核苷酸溶液，充分震蕩。
由于寡核苷酸合成中產生的不溶性苯并蒽，溶液常出現輕度棍濁。
2. 室溫下以微量離心機的最大離心轉速離心 5 min, 將上清移入新的無菌微量離心管。
3. 用 400ul 正丁醇（見附錄 8) 抽提溶液三次，去除上層有機相。
如果時間短，可省去異丁醇抽提，不會引起問題。此時，室溫下以最大離心轉速離心 5 min, 將上淸移入新的無菌微量離心管。將 10~30ul 原溶液加入變性聚丙烯酰胺凝膠的 6 個加樣槽（lcm), 見本章末的描述。
4. 室溫下用離心干燥機（Savant Speed Vac 或類似產品）將溶液干燥。離心管中應含有淺黃色沉淀物和乳白色粉末。
5. 用 200ul 無菌過濾水（Milli-Q 或相當級）溶解沉淀物和粉末。
6. 用下列方法估計樣品中寡核苷酸的量：將 1ul 溶液加到 1ml 水中，充分混合后測 OD260, 計算寡核苷酸濃度。
寡核苷酸量常以單位表示。1OD 相當于在 1 cm 光徑的比色杯中 1ml 溶液中的寡核苷酸量產生的光密度計算寡核苷酸亳摩爾消光系數（e）的公式如下：
e=A(15.2)+G（12.01)+C（7.05)+T（8.4)
式中 A、G、C、T 為寡核苷黢序列中各種核苷酸的倍數，括號中的數值為 pH8.0 時每種脫氧核苷酸的摩爾消光系數。例如，一個含 5 個 dA、4 個 dG、4 個 dC 和 6 個 dT 殘基的 19 聚體寡核苷酸的毫摩爾消光系數為
(5X15.2)+(4X12.01)+（4X7.05）+（6X8.4)=202.64 mmol/(L·cm)
按以下公式計算未稀釋的寡核苷酸液濃度（C):
C=(OD260)(1000)/s
凝膠電泳純化合成的寡核苷酸
7. 制備適當濃度（表 10-2) 的變性聚丙烯酰胺凝膠（第 12 章方案 8)，膠的加樣槽長度應在 1 cm 左右。
8. 用恒功率（50~70W）預電泳約 45 min 或凝膠溫度達 45~50°C。關電源后去掉電極插頭線。
預電泳可以使膠孔中的過硫酸銨移出，更重要的是讓凝膠升溫至 DNA 電泳的理想溫度。
9. 不要停頓，在一個或多個加樣槽內按下列方法加入約 2OD260 的寡核苷酸（為獲得最高分辨率，溶液體積應為 10ul 或<10ul):
a. 在寡核苷酸溶液中加入等體積的無染料甲酰胺加樣緩沖液，充分震蕩混勻，55°C 下加熱 5 min 以消除二級結構。
b. 用 1XTBE 將加樣孔中的尿素沖掉。
c. 將加熱過的寡核苷酸加入加樣孔。取 5ul 含染料的甲酰胺上樣液加入一個未使用的加樣孔中。
有關聚丙烯酰胺凝膠加樣的詳細內容，參見 12 章，方案 11。
10. 在 1500V 電壓下電泳，直至寡核苷酸移至凝膠的近 2/3 處。
可根據染料位置估計寡核苷酸的位置，詳見表
10-3。應注意，帶有
5'末端羥基的合成寡核苷酸在變性聚丙烯酰胺凝膠的移動速率比相同長度的磷酸化寡核苷酸要慢。而且，由于未知的原因，寡核苷酸泳動的速率取決于其堿基組成及序列。因此，聚丙烯酰胺凝膠中，寡核苷酸的預期位置與觀察到的位置之間沒有精確的對應關系。
11. 將凝膠模板平鋪在底部為塑料防護的試驗臺墊紙上，將帶槽口的小塊板向上。在進行下一步前，先將凝膠冷卻至 37°C 以下。
12. 去除多余的膠帶，用邊條或凝膠分離工具緩慢、小心地撬開凝膠模板，此時凝膠應黏著在較長的（未硅烷化）玻璃板上。
警惕戴好防護限鐐，進行此步驟時玻璃板可能會破碎。
如果凝膠黏附于兩塊破璃板上. 先將板放回原處，使較小的或帶槽的玻璃板背向凝膠，反轉玻璃板再試。
13. 將一張 Sarari 膜放在凝膠上，反轉玻璃板，這樣凝膠便轉貼到 Saraii 膜上。在預計寡核苷酸所在位置的凝膠下方，放一張石蠟封口膜或熒光薄層層析板。
14. 用手提式紫外燈在 260nm 波長從上方照射凝膠。
凝膠內的 DNA 吸收紫外光，在石蠟膜或熒光薄層層析板的熒光背聚下，DNA 呈現深藍色條帶。如果 DNA 條帶難以辨認，可以在暗室里用手提式紫外燈觀察。
15. 待回收的目標寡核苷酸應是遷移最慢的條帶（最靠近膠的頂端)，用鋒利、清潔的手術刀或剃須刀切下每一條目的 DNA 條帶，并注意不要取小于目的寡核苷酸的紫外吸收物。
有關切取目的 DNA 帶的其他內容，參見本方案末信息欄“聚丙烯酰胺凝膠中寡核苷酸的觀察”。
16. 將凝膠切片移入 3~4 個微量離心管中，在每一管中加入 1 ml 寡核苷酸洗脫緩沖液, 用一次性移液器吸頭在管中轉動并壓向管壁，將凝膠擠碎。封好管口，在搖動培養箱內 37°C 溫育 12 h。
含有SDS洗脫緩沖液在處理Sep-Pak層析第2、3組分干燥后，有時會產生乳白色沉淀，這些沉淀物很可能是結合于柱上的SDS,
當用甲醇-水洗脫時，在寡核苷酸稍后洗脫下來。只要SDS不與寡核苷酸共同存在(第一組分)，去污劑就不會引起問題，并可能改善回收率。但是，即使最后的寡核苷酸中有很少量的SDS，它也能抑制隨后的酶促反應（如磷酸化及引物延伸），這也是本洗脫液含SDS的原因。
17. 室溫下以微量離心機的最大離心轉速離心5 min, 收集上清，轉移到5 ml—次性注射器中，用Millex HV濾器過濾，收集過濾液于15 ml聚丙烯管中。
用Sep-Pak C18層析柱分離合成的寡核苷酸
18. 按下列步驟準備Sep-Pak C18反相層析柱：
a. 將10 ml—次性注射器針筒連接于Sep-Pak C18傳統層析柱的長端。
b. 在注射器針筒中加入10 ml乙腈，用柱芯緩慢推壓乙腈使其通過層析柱。
c. 取下注射器，將注射器柱芯拔出，這樣可以防止空氣抽入層析柱內。重新將注射器針筒連于層析柱。
d. 在針筒內加入10 ml過濾無菌水（Milli-Q級或相當級），用注射器柱芯緩慢推壓，使水通過層析柱。重復步驟c。
e. 將2 ml10 mml/L乙酸銨緩慢推出層析柱，取下注射器，移去注射器柱芯，將注射器針筒重新連于層析柱。此時層析柱已可使用。
19. 將凝膠純化寡核苷酸溶液加入注射器針筒中（步驟17)，推動注射器柱芯使其緩慢通過層析柱，用無菌的50 ml聚乙烯離心管收集洗脫液。重復步驟18c。
20. 用注射器緩慢將10 ml 水推入層析柱，重復沖洗二次以上。
21. 用lml甲醇-水溶液將結合于Sep-Pak C18層析柱上的寡核苷酸洗脫下來，共三次，每次洗脫后重復步驟18c。分別收集各次洗脫液，用甲醇-水溶液為空白，分別測定三只管內溶液的 OD260光吸收值。>90% 的寡核苷酸應存在于第一組分。
22. 用離心干燥機使含寡核苷酸的溶液揮發干燥。
23. 將寡核苷酸溶于總體積為 200ul 的水或 TE(pH8.0) 中。
24. 吸取 5ul 溶液加到含有 995ul水的比色杯中，混勻后，測定洗脫樣品的OD260 值，按本方案步驟 6 所述計算洛液中寡核苷酸總量（步驟 23)。
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