聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定IgG純度（二）

（三）操作方法

1．安裝夾心式垂直板電泳槽

夾心式垂直板電泳槽操作簡單，不易滲漏。這種電泳槽兩側為有機玻璃制成的電極槽，兩個電極槽中間夾有一個凝膠模，該模由一個上框形凝膠框、長與短玻璃板及樣品槽模板（梳子）所組成。電泳槽由上儲槽（白金電極在上或面對短玻璃板），下儲槽（白金電極在下或面對長玻璃板）和回紋狀冷凝管組成。兩個電極槽與凝膠模間靠儲液槽螺絲固定。各部間依下列順序組裝：

（1）將上儲槽和固定螺絲銷釘，仰放在桌面上。

（2）將上、短玻璃板分別插到上框形硅橡膠的凹形槽中。注意勿用手接觸灌膠面的玻璃。

（3）將已插好玻璃板的凝膠模平放在上儲槽上，短玻璃板應面對上儲槽。

（4）將下儲槽的銷孔對準已裝好螺絲銷釘的上儲槽 ，雙手以對角線的方式旋緊螺絲帽 。

（5）豎直電泳槽，在長玻璃板下端與硅膠模框交界的縫隙內加入已融化的1%瓊脂（糖）。其目的是封住空隙，凝固后的瓊脂（糖）中應避免有氣泡。

2．配膠

① 分離膠 20ml pH8.9 7.0 %PAA溶液中，凝膠緩沖液（pH8.9）2.5ml，分離膠貯液5.0ml，重蒸餾水2.5ml，充分混勻，抽氣10min，后加AP 10 ml。

② 濃縮膠 pH6.7 25% PAA：濃縮膠緩沖液∶濃縮膠貯液∶40%蔗糖溶液∶核黃素溶液按1∶2∶4∶1的比例混合。

3．制備凝膠板

不連續體系采用不同孔徑及pH的分離膠與濃縮膠 ，凝膠制備應分2步進行。

① 分離膠的制備：根據實驗要求，選擇終丙烯酰胺的濃度，本實驗需20ml pH8.9 7.0 %PAA溶液，其加膠方式不同于連續系統。混合后的凝膠溶液，用細長頭的滴管加至長、短玻璃板間的窄縫內，加膠高度距樣品模板梳齒下緣約1cm。用1cm注射器在凝膠表面沿短玻璃板邊緣輕輕加一層重蒸水（約3-4mm）用于隔絕空氣，使膠面平整。為防止滲漏，在上、下儲槽中加入略低于膠面的蒸餾水。約30-60min凝膠完全聚合，則可看到水與凝固的膠面有折射率不同的界線。用濾紙條吸去多余的水，但不要碰破膠面。如需預電泳，則上、下儲槽的蒸餾水倒去，換上分離膠緩沖液，10mA電流電泳1h，終止電泳后，棄去分離膠緩沖液，用注射器取濃縮膠緩沖液洗滌膠面數次，即可制備濃縮膠。

② 濃縮膠制備：濃縮膠為pH6.7 25% PAA，混合均勻后用細長的滴管將凝膠溶液加到長、短玻璃板的窄縫內（即分離膠上方），距短玻璃板上緣0.5cm處，輕輕加入樣品槽模板。在上、下儲槽中加入蒸餾水，但不能超過短玻璃板上緣。在距離電極槽10cm處，用日光燈或太陽照射，進行光聚合，但不要造成大的生溫。在正常情況下，照射6-7min，則凝膠由蛋黃透明變成乳白色，表明聚合作用開始。繼續光照30min，使凝膠聚合完全。光聚和完成后放置30-60min，輕輕取出樣品槽模板，用窄條濾紙吸去樣品凹槽中多余的液體，加入稀釋10倍pH8.3的Tris-甘氨酸電極緩沖液。使液面沒過玻璃板約0.5cm，即可加樣。

4．加樣

作為分析用的PAGE加樣量僅需幾微克，2-3ul血清電泳后就能分出幾十條蛋白區帶。為防止樣品擴散，應在樣品中加入等體積40%蔗糖（內含少許溴酚蘭）。用微量注射器取5ul上述混合液，通過緩沖液，小心地將樣品加到凝膠凹形樣品槽底部，待所有凹形樣品槽內都加了樣品，即可開始電泳。

5．電泳

將直流穩壓電泳儀的正極與下槽連接，負極與上槽連接（方向切勿接錯）。接通冷卻水，打開電泳儀開關，開始時將電流調至10 mA 。待樣品進入分離膠時將電流調至20-30mA。當藍色染料遷移至距離橡膠框下緣1cm時，將電流調回到零，關電源及冷卻水。分別收集上、下貯槽電極緩沖液置試劑瓶中，4℃貯存還可用1-2次。旋松固定螺絲，取出硅橡膠框，用不銹鋼鏟輕輕將一塊玻璃板撬開移去，在膠板一端切除一角作為標記，將膠板移至大培養皿中染色。

6．固定，染色

本實驗采用0.05%考馬斯亮藍R250（內含20%磺基水楊酸）染色液，染色與固定同時進行，使染色液沒過膠板，染色30min左右。

7．脫色

用7%乙酸侵泡漂洗數次，直至背景藍色褪去。如用50℃水浴或褪色搖床，則可縮短褪色時間。脫色液經活性碳脫色后，可反復使用。