實驗材料 DNA
試劑、試劑盒 TE無水乙醇DNA聚合酶CTP
儀器、耗材 電泳儀離心機PCR儀
實驗步驟
1. 制備模板DNA，如DNA不是經氯化銫梯度純化的，100℃煮沸10 min 以滅活核酸酶。
2. 制備寡核苷酸引物，若PCR產物要進行平端克隆，就應該對引物的5’端羥基進行磷酸化處理。
圖一、用PCR反應引入單一的酶切微點和產生符合讀碼框架的融合蛋白。
3. 建立標準的擴增反應，以礦物油覆蓋表面，在以下條件下進行20~25輪擴增循環：94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸3 min，最后一個循環在72℃延伸10 min 盡可能使擴增產物完整。
圖二、序貫PCR法構建重組DNA分子，引物1b與基因2同源區域；引物1c有與基因1同源區域
4. 取少量反應混合物（4~8 μl），用瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴增效果。
5. 吸去礦物油上層，用氯仿抽提1次除去殘存的礦物油，用飽和酚抽提1次，然后用無水乙醇沉淀DNA。
圖三、用反向PCR插入酶切位點
6. 4℃高速離心10 min，沉淀用20 μl TE緩沖液溶解。
7. 用玻璃珠，電冼脫或低融點膠的酚抽法進一步純化PCR產物可去除未摻入dNTP引物、無關的PCR產物和模板DNA。
8. 對于通過平端連接進行的克隆：用DNA聚合酶I （或klenow酶）修平擴增片段的3‘末端。
9. 對于通過粘端連接進行的克隆：在20 μl 體積用合適的酶消化一半PCR只產物，用過量的酶消化數小時。
10. 用合適的末端互補的酶在20 μl 體積內消化0.2~2 μg 載體DNA，用CIP去瞵酸化，以阻止載體自連。
11. 用普通瓊脂糖或低融點瓊脂溏電泳分離線性化的載體。
12. 用玻璃珠、電洗脫、或酚抽法回收線狀的載體。
13. 連接PCR片段和線狀載體。
14. 取部分連接產物轉化大楊桿菌，從轉化體集中以小量制備法提取質粒DNA。
15. 用合適的酶消化轉化體的質粒DNA，以瓊脂糖凝膠電泳分析以確證片段的插人。
16. 測定質粒DNA中擴增片段的序列，檢查有無突變，或者用生物化學或遺傳學方面的功能分祈篩選轉化體。