聚合酶鏈反應（PCR）在石蠟包埋組織中的應用

  PCR是一種模擬天然DNA復制過程，在體外將特異性目的DNA片段序列進行高效擴增的分子生物學新技術。自八十年代由美國Muilis發明這項技術以來，由于具有快速、敏感、特異及高效的特點，得以迅速推廣，并從這一分子生物
學基本技術擴展出一系列分子生物學研究方法。PCR擴增所需的模板DNA來源，也由從新鮮組織細胞、冰凍組織中提取到可從石蠟包埋組織中獲得。

         一、石蠟包埋組織PCR的意義：
          1、對疑難病例的診斷和鑒別診斷：
   由于PCR檢測的高敏感性和高特異性，如用于IgH/TCR基因重排時敏感 性達10-4 ～10-6 ，一些衍生的PCR方法還可進一步提高敏感性，因此，是提高診斷率的一個重要輔助手段。
          2、 結束了DNA研究依賴于新鮮、冰凍組織和細胞的歷史，可以滿足某些腫瘤分子生物學研究的需要。
          3、 用于回顧性研究：大量存檔的石蠟包埋組織可充分利用，對腫瘤發生的分子機制進行探討。
          4、對疾病的形態學、免疫表型和基因改變作相關性分析。

         二、PCR對石蠟包埋組織的要求：
           組織固定和石蠟包埋制片過程與免疫組化要求基本相同，但需注意：
               1、含血多的組織先用生理鹽水洗后再固定。
               2、壞死組織必須去除。
               3、甲醛固定時間越長對DNA破壞越嚴重，因此固定時間最好不超過24小時。
               4、避免交叉污染，組織切片放入無菌AP管或撈于干凈的載玻片上。
              5、切片應具有一定的厚度，一般約5-10微米。

         三、石蠟包埋組織DNA的提取方法：
           1、酚抽提法：
              酚抽提法是DNA的常規提取方法，比較穩定。
a\石蠟包埋組織切片（5-7微米）1-5片放入1.5毫升無菌AP管中。
 b、加二甲苯1毫升脫蠟10分，離心10000r/5分，棄上清，重復二次。
 c、加無水乙醇1毫升洗二甲苯5分，離心6000r/5分，棄上清，重復二次。
d 、將AP管蓋打開，放入37℃恆溫箱內干燥組織0.5小時，取出放室溫，使乙醇盡量揮發。
e 、加消化液0.5毫升混勻，37～50℃水浴消化過夜，至組織完全消化為止。
                                    PH8.0  10mM Tris-HCL Buffer                                      
                                     1mM EDTA
          消化液成分：  10%SDS 終濃度25微克/毫升
                                    20mg/ml PK 終濃度500微克/毫升    
           f 、組織消化后取出AP管，離心12000r/10分，小心吸出上清（DNA）于另一AP管內，棄沉淀。
           g 、在上清內加1倍體積飽和酚輕輕顛倒混勻，離心6000r/5分，此時液體分為三層，從上至下為：上清（DNA）--蛋白質--酚，小心吸出上清至另一AP 管中。                       
           h 、加1倍體積酚/氯仿（1：1）混合液，輕輕顛倒混勻，離心6000r/5分，此時管內液體分為兩層，上清（DNA），下層有機試劑（細胞密度大，蛋白質含量豐富的組織，有時中間層也出現少量的蛋白質），小心吸出上清至另一AP管中。
           i 、 加1倍體積氯仿/異戊醇（24：1）混合液，輕輕顛倒混勻，離心6000r/5分,此時管內液體分為兩層，上清（DNA），下層有機試劑，小心吸出上清液至另一AP管中。
           j 、 DNA沉淀：加1/10體積的PH5.2、3M/L NaAC緩沖液，混勻，再加2倍體積-20℃預冷無水乙醇，混勻后放-20 ℃2小時以上或過夜。
           k、 離心12000r/15分，棄上清，管內沉淀即為DNA。
           L、 加1倍體積75%乙醇洗沉淀，室溫放5分，離心12000r/15分，棄上清，沉淀室溫自然晾干。
           m、 加無菌去離子水（或TE液）適量溶解DNA，放4 ℃冰箱保存待用。
         2、粗提法：（粗提+刮片法）
           a、石蠟包埋組織切片（5～7微米）1～5片，貼于干凈的載玻片上，烤干。
           b、二甲苯脫蠟10分× 3次。
           c、無水乙醇洗二甲苯5分× 3次，切片自然干燥。
           d 、 用無菌刀片，將脫蠟后的組織從玻片上刮下，收集于無菌AP管中。
           e、加消化液0.1ml，輕輕混勻，在37～50℃水浴中消化過夜。
                                       PH8.0  50mM  Tris-Hcl  Buffer
             消化液成分：  10mM  EDTA                                                                       
                                        0.5%（V/V) Tween-20                                                              
                                       100- 200微克 PK
           f 、 待組織完全消化后，將AP管移入沸水中煮10分，滅活蛋白酶K的活性。
           g、 離心10000r/10分，取上清即為DNA模板，放4℃冰箱備用。

         兩種提取方法的比較：
         酚抽提法： 有機試劑的多次抽提，可消除石蠟包埋組織因固定所造成的理化性質的改變。亦可消除一些DNA聚合酶的抑制因素，故DNA純度較高、穩定、重復性好，適用范圍廣。不足之處是步驟較多，DNA丟失嚴重，不適于少量標本的DNA提取。
         粗提與刮片法： 快速，省去了多次離心的繁雜步驟，減少了DNA的丟失。不僅適用于未染色的組織切片，而且還適用于經HE、免疫組化染色的組織切片。最突出的優點是可在光鏡下選擇性刮取所需組織，去除抑制PCR反應的出血、壞死等組織，提高陽性檢出率，為臨床基因檢測和科研工作      密切結合及同步觀察提供了一個較為實用的方法。適用于少量標本的DNA提取。不足之處是產品較粗，重復性較差，不適于對DNA質量要求高的檢測技術（如DNA測序）。                      
     選擇何種方法提取DNA，主要看實驗的目的。PCR擴增對DNA模板要求不高，粗品也能擴增產生大量特異性DNA拷貝。但是為了提高PCR敏感性和可重復性，模板DNA盡可能地純化，除去提取物中某些抑制PCR反應的成分。    
         四、DNA純度的測定：
           1、分光光度法測定DNA含量：
                利用分光光度法測定DNA中堿基吸收紫外輻射的量。DNA最大吸收波長為260nm，蛋白質為280nm。根據260/280的讀數比值估計DNA的純度。260/280比值在1. 60-1. 80之間較好，比值過高（ 1.85）可能有RNA污染，比值過低（1.60）可能有蛋白質污染。一個OD值相當于大約50μg/ml雙鏈DNA。
           2、溴化乙啶（EB）熒光法：
                DNA含量 ＜250ng/ml或DNA樣品中雜質含量較高時用。EB可嵌入DNA 分子，在紫外光下產生熒光，熒光強度與DNA含量成正比，以此估計DNA含量。
         五、提高DNA質量的方法：
           1、組織的固定和包埋：10%中性甲醛固定時間不應太長，一般在12-24小時之內，包埋過程避免溫度過高，大約62 ℃左右。
           2、石蠟包埋組織塊的選擇：石蠟切片結構不清，有大片出血的蠟塊不用；有明顯壞死存在的蠟塊最好不用，或切去壞死部分再用；盡可能選用近期的蠟塊。
           3、改善提取方法：需要根據組織類型調整消化液中各組分的濃度和消化時間。
           4、避免DNA機械損傷：切片不能太薄，操作過程要輕，避免過多移管，以防人為的DNA剪切。
         六、DNA的儲存：
               提取或純化的DNA，最好用TE buffer溶解（也可用無菌去離子水溶解），4 ℃ 保存待用。短期內不用可放-20℃凍存，DNA溶液可保存6個月，凍干后保存期1-2年，-70 ℃能保存5年以上。長期保存時，可在DNA樣品中加入1滴 氯仿避免細菌和/或核酸酶的污染。切忌反復凍融，以免DNA降解。    
         七、PCR原理及步驟：
              聚合酶鏈反應是基于體外模擬DNA的天然復制過程，在有模板DNA、引物 和四種脫氧核糖核苷酸存在的條件下，依賴DNA聚合酶的酶促合成反應。
         原理：      靶序列
         --------------------------------------  DNA模板              
  
         --------------------------------------

                            
                                           
         --------------------------------------   變性    在高溫下，待擴增的靶DNA雙鏈受熱變性，磷酸二酯鍵斷裂成兩條單鏈DNA                               
         ----------------------                               
                              
  

        ----------------------  退火  在低溫（45-67 C）下，兩條人工
                                       合成的寡核苷酸引物與互補的單鏈
                                        DNA模板結合，形成部分雙鏈      
        ------------------------
                                      

         -----------------------  延伸    在TaqDNA聚合酶催化下，以 
                                          引物3端為合成起點，以單核
                                          苷酸為原料，沿模板5，→3，
         -------------------------------------          方向延伸合成DNA新鏈。
                                                 
                     一個PCR循環

         每一個循環產生的DNA均為下次循環的模板，經25～35個循環后，理論上可使基因擴增109 倍以上，實際106 ～107倍。   
          以PCR檢測免疫球蛋白重鏈（IgH）和T細胞受體（TCR）基因重排為例，簡述PCR擴增過程。
          原理：
              淋巴細胞在分化發育過程中，TCR和IgH編碼基因發生重排，即可變區（V）與結合區（J）之間兩個距離很遠的片段重新排列在一起，形成新片段。這些新片段是每個淋巴細胞克隆特有的標記。用V區相對保守的寡核苷酸序列作引
物一端，J區的一段序列作引物另一端進行PCR擴增，結果：正常淋巴細胞的重排過程具有隨機性和多態性，擴增后產物電泳圖像呈彌漫分布，無明顯重排帶；而淋巴系統惡性腫瘤由于某一階段發生突變呈克隆性增殖的瘤細胞為同一基因結構，形成單克隆性重排，擴增后產物電泳呈一狹窄的重排帶，這 就成為淋巴系統疾病基因診斷的分子生物學基礎。
            
 

  1、PCR反應體系（25微升體積）：

                         100mM/L  Tris-HCl  PH8.0
                         15mM/L  KCl
       PCR  buffer       15mM/L  MgCl 
                         0.01% (w/v)  明膠                                                       
       dNTP (1mM/L)
       引物 （20μM/L）
       Taq DNA 聚合酶 （ 2u/μl  ）
       模板DNA   ( 50ng～1μg)
       無菌去離子水   （補足體積）
         
            2、PCR反應條件：
  IgH：采用一對半（三條）引物兩輪擴增，也稱半巢式擴增。
        第一輪引物： FR2 A、  LJH 或 FR3 A、 LJH
                    循環參數：  預變性 95 ℃ 3分
                                變性   94 ℃ 40秒
                                退火   62 ℃ 50秒
                                延伸   72 ℃ 40秒    
                                30個循環
        第二輪： 將第一輪產物以1：50--1：1000無菌去離子水稀釋后作模板。引物： FR 2A、 VLJH 或 FR 3A、 VLJH
                    循環參數： 變性  94 ℃ 40秒
                               退火  60℃50秒
                               延伸  72 ℃40秒
                         25個循環后，再延伸72 ℃10分。

                TCRγ：采用8條引物混合單輪擴增。
       引物： V2、V3、V4、V8、V9、JGT12、JGT3、JGT4
                            循環參數： 預變性 94℃ 6分
                                變性   94 ℃ 1分
                                退火   55 ℃ 1分
                                延伸   72℃ 1分
                         40個循環后，再延伸72 ℃10分。    
           八、PCR擴增中須注意的問題：
             1、設相應的對照：
    陽性對照：瘤細胞株或已知有單克隆性重排的淋巴瘤。
    陰性對照：淋巴結反應性增生或無模板的DNA擴增產物。
             2、注意PCR擴增過程中的污染：
     器皿和試劑經高壓消毒，試劑小量分裝，操作時戴手套，最好在超凈臺內工作。
             3、Taq DNA聚合酶雖具耐熱性，但長時間高溫也會使酶活力下降，應盡量減少高溫加熱時間。
             4、Taq酶對Mg2+ 十分敏感，是Mg2+ 的依賴酶。
反應體系中dNTP、引物、模板DNA及buffer中的EDTA均能與Mg2+ 結合，影響自由Mg2+濃度。反應體系中這些試劑的用量，尤其是模板DNA用量，要保持相對恒定。             5、PCR是一個復雜的體系，許多組分和條件互相制約，改變某一條件會涉及其它因素，無統一標準的最佳條件。應在通用條件基礎上，通過實驗適當調整，以確定自己的最適條件。         
 九、PCR擴增產物的分析：
      PCR擴增產物的長度由引物間距離決定。產物長度不同，電泳過程中泳動速度不同，將其與標準DNA Marker對照，就能確定出產物的bp大小。
             1、聚丙烯酰胺凝膠電泳：
    濃度視待分析產物bp大小而定，EB（溴化乙啶）染色，紫外透射儀下觀察特定區域條帶。也可用銀染色，肉眼觀察結果。此法敏感性高，主要用于5～500bp的小片段產物。
             2、瓊脂糖凝膠電泳：
            視待測產物bp大小而定，EB染色，紫外透射儀下觀察特定區域條帶。
           此法敏感性稍低，主要用于200bp～50kb的大片段產物。
        陽性標準：a、陽性、陰性對照結果正常。
                  b、電泳條帶清晰，寬度在2mm以內。
                  c、片段大小與引物特定的范圍相符。
                  d、特異性陽性條帶亮度大于非特異性帶。      
            十、常用試劑的配制：
           1、20mg/ml 蛋白酶K （PK）：
                 稱20mg PK，無菌去離子水1ml溶解，分裝，-20 ℃凍存。
           2、PH8.0  TE液：
              儲存液：
                 1M Tris-HCl： 稱Tris-堿12.1g，溶于去離子水，濃鹽酸調PH至 8.0,
                定溶100ml，高壓滅菌。
0. 5M EDTA：稱乙二胺四乙酸二鈉18.6g，溶于去離子水，10N NaOH
調PH至8.0，定容100ml   ，高壓滅菌。                                                            
              應用液：  
                 A：   PH8.0    0.01M  TE
                              1M  Tris-HCl 1ml.  0.5M  EDTA 0.2ml.加去離子水98.8 
                       ml混勻，高壓滅菌。
                 B：   PH8.0    0.05M  TE    
                               1M  Tris-HCl 5ml.  0.5M  EDTA 2ml.  吐溫-20 
                       0.5ml，加無菌去離子水92.5 ml 混勻，高壓滅菌。
           3 、 PH5.2   3M/L  NaAC  buffer：
                     稱NaAC.3H2 O  40.8g去離子水溶解， HAC調節PH至5.2，定容
                100ml，高壓滅菌。
           4、10%（W/V）十二烷基硫酸鈉（SDS）：
                  稱SDS 1g，加無菌去離子水溶解，定容10ml，4 ℃儲存。
        十一、石蠟包埋組織PCR擴增中存在的問題：
    1、引物設計不夠廣譜，存在假陰性，或/和操作環節不當及其它原因所致的假陽性。
    2、結果判定無統一標準。
    3、由于影響因素較多，DNA模板質量不穩定，重復性較差。
    4、操作和試劑無標準化，設備條件要求高，技術難度也較大。
    5、PCR反應受抑制物影響，成功率還有待提高。
        十二、石蠟包埋組織PCR檢測的應用：
           1、淋巴系統良惡性疾病的診斷和鑒別診斷。
            包括惡性淋巴瘤與淋巴組織反應性增生的鑒別；淋巴系統惡性腫瘤的分型；淋巴瘤的骨髓轉移等。
           2、血液系統其它惡性疾病的基因檢測。
           3、微小殘留病變的監測。
        目前微小殘留病（MRD）的檢測主要有3種方式：熒光原位雜交（FISH）；多聚酶鏈反應(PCR)和流式細胞術（FACS）。FISH檢測殘留白血病細胞某些特殊的染色體異位；RT-PCR檢測易位后形成的嵌合基因；PCR檢測MRD細胞的Ig/TCR基因重排；FACS檢測MRD細胞特有的分化抗原。
           4、白血病耐藥基因的研究。
           5、分析癌基因和抗癌基因。