聚合酶鏈反應（PCR）技術的發展和應用1

第一節　概述

　　聚合酶鏈反應或多聚酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction, PCR），又稱無細胞克隆技術(“free bacteria”cloning technique)，是一種對特定的DNA片段在體外進行快速擴增的新方法。該方法一改傳統分子克隆技術的模式，不通過活細胞，操作簡便，在數小時內可使幾個拷貝的模板序列甚至一個DNA分子擴增10⁷～10⁸倍，大大提高了DNA的得率。因此，現已廣泛應用到分子生物學研究的各個領域。

　　PCR技術最早由美國Cetus公司人類遺傳研究室Kary Mullis及同事于1985年發現并研制成功的；最早的應用報道是Saiki等1985年將PCR技術應用于β-珠蛋白基因擴增和鐮刀狀紅細胞貧血的產前診斷。隨后使用了1976年Chien等分離的熱穩定性Taq DNA聚合酶，使PCR操作大為簡化，并使PCR自動化成為可能；1987年Kary Mullis等完成了自動化操作裝置，使PCR技術進行實用階段。

　　國內復旦大學1988年起開始研制耐熱性多聚酶，軍事醫學科學院馬立人教授等在1989年研制成功了PCR自動裝置，并且不斷推陳出新，最近研制的PTC-51A/B型DNA熱循環儀體積小，造型美觀，價格適宜，操作簡單，尤為適宜國內應用。

　　PCR發明不到10年，卻已獲得廣泛應用。目前，每年都有上千篇文章　發表。1991年，期刊“PCR方法與應用”（PCr Methods and Application）在美國創刊，使有關學者有了自己的論壇和參考的專業期刊。PCR技術作為一種方法學革命，必將大大推動分子生物學各有關學科的研究，使其達到一個新的高度。

　　1993年度諾貝爾化學將已于10月13日揭曉，Kary Mullis因發明了“聚合酶鏈式反應”而獲得此殊榮。現在世界各地都在使用PCR檢測病人血液中的微量遺傳物質，這一成就為精確診斷艾滋病及其它病癥鋪平了道路。瑞典皇家科學院說：“PCR方法已經廣泛應用于生物醫學中。該方法同DNA測序法結合起來很可能將成為研究動植物分類學的一種革新工具。”一名加拿大籍英國科學家Michael Smith因開創了“寡核苷酸基因定點誘變”的方法而與Mullis同享此榮。

第二節　PCR技術的原理

　　PCR是體外酶促合成特異DNA片段的新方法，主要由高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個步驟反復的熱循環構成：即在高溫（95℃）下，待擴增的靶DNA雙鏈受熱變性成為兩條單鏈DNA模板；而后在低溫（37～55℃）情況下，兩條人工合成的寡核苷酸引物與互補的單鏈DNA模板結合，形成部分雙鏈；在Taq酶的最適溫度（72℃）下，以引物3’端為合成的起點，以單核苷酸為原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新鏈。這樣，每一雙鏈的DNA模板，經過一次解鏈、退火、延伸三個步驟的熱循環后就成了兩條雙鏈DNA分子。如此反復進行，每一次循環所產生的DNA均能成為下一次循環的模板，每一次循環都使兩條人工合成的引物間的DNA特異區拷貝數擴增一倍，PCR產物得以2ⁿ的批數形式迅速擴增，經過25～30個循環后，理論上可使基因擴增10⁹倍以上，實際上一般可達10⁶～10⁷倍。

圖22-1　PCR基本原理示意圖

　　假設擴增效率為“X”，循環數為“n”，則二者與擴增倍數“y”的關系式可表示為：y=(1+X)ⁿ。擴增30個循環即n=30時，若X=100%，則y=2³⁰=1073741824(>10⁹)；而若X=80%時，則y=1.8³⁰=45517159.6(>10⁷)。由此可見，其擴增的倍數是巨大的，將擴增產物進行電泳，經溴化乙錠染色，在紫外灶照射下（254nm）一般都可見到DNA的特異擴增區帶。

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第三節　PCR操作范例及反應體系的組成

　　一、PCR操作范例

　　在一個典型的PCR反應體系中需加入：適宜的緩沖液、微量的模板DNA、4×dNTPs、耐熱性多聚酶、Mg²⁺和兩個合成的DNA引物。模板DNa 94℃變性1min，引物與模板40～60℃退火1min，72℃延伸2min。在首次循環前模板預變性3～5min；在末次循環后，樣品仍需繼續延伸3～5min以上，確保擴增的DNA為雙鏈DNA。為便于了解PCR反應中各成份的組成，加入量和反應條件，使人們以此為基礎，對不同的研究對象逐項改變來找到最佳反應條件，特列舉Perkin Elmer Cetus公司Gene Amp DNA試劑盒提供的典型反應條件供參考。

表22-1 PCR反應混合液

　　擴增條件：94℃60s,37℃60s,72℃120s,共25～30個循環。

　　注：[1]反應緩沖液[10×]含：100mmol/l Tris-HCl pH8.3(25℃),

　　15mmol/L KCl, 15mmol/L MgCl₂,

　　0.01%(W/V)明膠（Sigma G2500）

　　[2]酶儲存緩沖液（-20℃）含：50%甘油，100mmol/l KCl,

　　20mmol/L Tris-HCl ph8.0

　　0.1mmol/L EDTA, 1.0mmol/L DTT

　　200μg/ml明膠

　　0.5%吐溫20，0.5% Nonidet P40

　　[3][4]引物，1，2：擴增λ-噬菌體基因中500bp的片段

　　引物1序列：7131～7155（5’）-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACTGG-(3’)

　　引物2序列：7606～7630（5’）-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC-(3’)

　　注意（3’）端有2個bp互補故易生成50bp的雙體

　　二、PCR反應系統的組成

　　（一）PCR緩沖液（PCr Buffer）

　　用于PCR的標準緩沖液見PCR操作范例。于72℃時，反應體系的pH值將下降1個單位，接近于7.2。二價陽離子的存在至關重要，影響PCR的特異性和產量。實驗表明，Mg²⁺優于Mn²⁺，而Ca²⁺無任何作用。

　　1．Mg²⁺濃度Mg²⁺的最佳濃度為1.5mmol/L(當各種dNTP濃度為200mmol/L時)，但并非對任何一種模板與引物的結合都是最佳的。首次使用靶序列和引物結合時，都要把Mg²⁺濃度調到最佳，其濃度變化范圍為1～10mmol/L。Mg²⁺過量易生成非特異性擴增產物，Mg²⁺不足易使產量降低。

　　樣品中存在的較高濃度的螯合劑如EDTA或高濃度帶負電荷的離子基團如磷酸根，會與Mg²⁺結合而降低Mg²⁺有效濃度。因此，用作模板的DNA應溶于10mmol/l Tris-HCl(pH7.6)0.1mmol/L EDTA中。

　　dNTP含有磷酸根，其濃度變化將影響Mg²⁺的有效濃度。標準反應體系中4×dTNPs的總濃度為0.8mmol/L，低于1.5mmol/L的Mg²⁺濃度。因此，在高濃度DNA及dNTP條件時，必須相應調整Mg²⁺的濃度。

　　2．Tris -HCl緩沖液在PCR中使用10～50mmol/L的Tris –HCl緩沖液，很少使用其他類型的緩沖液。Tris緩沖液是一種雙極化的離子緩沖液，pKa為8.3(20℃),△pKa為0.021/℃。因此，20mmol/l Tris pH8.3(20℃)時，在典型的熱循環條件下，真正的pH值在7.8～6.8之間。

　　3．KCl濃度K⁺濃度在50mmol/L 時能促進引物退火。但現在的研究表明，NaCl濃度在50mmol/L時，KCl濃度高于50mmol/L將會抑制Taq酶的活性，少加或不加KCl對PCR結果沒有太大影響。

　　4．明膠明膠和BSA或非離子型去垢劑具有穩定酶的作用。一般用量為100μg/ml，但現在的研究表明，加或不加都能得到良好和PCR結果，影響不大。

　　5．二甲基亞砜（DMSO）　　在使用Klenow片段進行PCR時DMSO是有用的；加入10%DM－SO有利于減少DNA的二級結構，使（G+C）%含量高的模板易于完全變性，在反應體系中加入DMSO使PCR產物直接測序更易進行，但超過10%時會抑制Taq DNA聚合酶的活性，因此，大多數并不使用DMSO。

　　（二）四種脫氧三磷酸核苷酸（4×dNTPs）

　　在PCR反體系中dNTP終濃度高于50mmol/L會抑制Taq酶的活性，使用低濃度dNTP可以減少在非靶位置啟動和延伸時核苷酸錯誤摻入，高濃度dNTPs易產生錯誤摻入，而濃度太低，勢必降低反應物的產量。PCR常用的濃度為50～200μmol/L，不能低于10～15μmol/L。四種dNTP的濃度應相同，其中任何一種濃度偏高或偏低，都會誘導聚合酶的錯誤摻入，降低合成速度，過早終止反應。

　　決定最低dNTP濃度的因素是靶序列DNA的長度和組成，例如，在100μl反應體系中，4×dNTPs濃度若用20μmol/L，基本滿足合成2.6μg DNA或10pmol的400bp序列。50μmol/L的4×dNTPs可以合成6.6μg DNA,而200μmol/L足以合成25μg/DNA。

　　購自廠商的dNTP溶液一般均未調pH，應用1mol/l NaOH將dNTP貯存液pH調至7.0，以保證反應的pH值不低于7.1。市購的游離核苷酸凍干粉，溶解后要用NaOH中和，再用紫外分光光度計定量。

　　（三）引物的量

　　引物在PCR反應中的濃度一般在0.1～1μmol/L之間。濃度過高易形成引物二聚體且產生非特異性產物。一般來說用低濃度引物經濟、特異，但濃度過低，不足以完成30個循環的擴增反應，則會降低PCR的產率。

　　（四）Taq DNA聚合酶的量

　　典型PCR反應混合物中，所用酶濃度為2.5U/μl，常用范圍為1～4U/100μl。由于DNA模板的不同和引物不同，以及其它條件的差異，多聚酶的用量亦有差異，酶量過多會導致非特異產物的增加。

　　由于生產廠家所用兵配方、制造條件以及活性定義不同，不同廠商供應的Taq DNA聚合酶性能也有所不同。

　　Cetus公司酶定義是：1個酶單位是指在以下分析條件下，于74℃，30min內使10nmmol的dNTP摻入酸不溶性成分所需的酶。測定時間為10min，折算成30min摻入量。

　　分析條件為25nmol/L TAPS（三羥基-甲基-氨基丙烷磺酸鈉pH9.3,25℃）,50mmol/l KCl, 2mmol/L MgCl₂,1mmol/L β-ME（巰基乙醇），dATP、dTTP、dGTP各200mmol/L，dCTP為100mmol/L(由不標記及α-³²P標記混合)，12.μg變性鯡魚精子DNA，最終體積50μl。

　　（五）模板

　　單、雙鏈DNA或RNA都可以作為PCR的樣品。若起始材料是RNA，須先通過逆轉錄得到第一條cDNA。雖然PCR可以僅用極微量的樣品，甚至是來自單一細胞的DNA，但為了保證反應的特異性，還應用ng級的克隆DNA，μg水平的單拷貝染色體DNA或10⁴拷貝的待擴增片段作為起始材料，模板可以是粗品，但不能混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制劑以及能結合DNA的蛋白。

　　DNA的大小并不是關鍵的因素，但當使用極高分子量的DNA（如基因組的DNA時），如用超聲處理或用切點罕見的限制酶（如Sal₁和Not₁）先行消化，則擴增效果更好。閉環靶序列DNA的擴增效率略低于線狀DNA，因此，用質粒作反應模板時最好先將其線狀化。

　　模板靶序列的濃度因情況而異，往往非實驗人員所控制，實驗可按已知靶序列量逆減的方式（1ng,0.1ng,0.001ng等），設置一組對照反應，以檢測擴增反應的靈敏度是否符合要求。

　　（六）石蠟油