擴增已知基因時經過初次篩選和二次篩選后得到的引物基本上能夠滿足要求,但是當運用比較基因組學分離新基因時,設計引物還應注意以下兩點:
① 模板的選擇。如果以DNA為模板設計引物, 首先在Genebank中找到與待分離新基因同源的其它物種的該基因。
利用工具把已檢索到的基因進行同源性比較,根據比較基因組定位的原理,選擇研究深入、標記稠密的人和哺乳動物(如小鼠)保守功能基因DNA序列設計引物,該引物區段要求在各物種間絕對保守,差異不要大于2 bp,特別是3’端必須完全同源。如果以電腦克隆策 略獲得的待分離物種新基因的EST一重疊群為模板設計引物,要求ESTs與信息探針之間同源性大于80%,長度大于100 bp,并且避免在EST的并接部位和可能的外顯子與內含子剪接位點處設計引物。
②引物序列最好位于相臨的外顯子區且至少距離外顯子與內含子剪接處25 bD以上,這樣便于對擴增出來的片段進行功能鑒定和表型分析。