聚合酶鏈式反應體外擴增DNA
1. 按以下次序，將各成分加在0.5 ml滅菌離心管、擴增管或滅菌滴定板的孔內混合：
10×擴增緩沖液 5μl
20 mmol/L 4種dNTP混合液（pH 8.0） 1μl
20 μmol/L正向引物 2.5μl
20 μmol/L反向引物 2.5μl
1～5 U/μl熱穩定DNA聚合酶 1～2 單位
H2O 28～33μl
模板DNA 5～10μl
總體積 50μl
下表提供標準PCR反應條件
Mg2+ | KCL | dNTPs | 引物 | DNA聚合酶 | 模板DNA |
1.5mmol/L | 50mmol/L | 200μmol/L | 1μmol/L | 1～5單位 | 1pg~1μg |
2. 如果PCR儀沒有配置加熱蓋，在反應混合液的上層應加一滴輕礦物油（約50μl），防止樣品在PCR反應多個循環過程中蒸發。如果應用熱啟動方案程序，在反應混合液的上層可加一層石蠟油。放置微量離心管或微量滴定板在PCR儀上。
3. 按以下方法進行PCR擴增。典型的程序有變性、復性和聚合（延伸反應）；相應的循環條件與溫度列表如下：
循環數 | 變性 | 復性 | 聚合 |
30個循環 | 94℃ 30s | 55℃ 30s | 72℃ 1 min |
末輪循環 | 94℃ 1 min | 55℃ 30s | 72℃ 1 min |
這些循環數設置合適50μl反應體系在0.5 ml薄壁離心管內進行，反應管溫育在PCR儀上進行靶基因擴增，所用PCR儀可以是Perkin-Elmer9600或9700；也可以是Eppendorf公司的Master cycler PCR儀；也可以是MJ Research公司的PTC100。這里的循環數與溫度設置條件也可能適合在其他類型的設備及不同的反應體積。
聚合反應應該根據靶基因的長度按每分鐘聚合1000 bp的速率來計算所要設置進行聚合反應的時間。大多數PCR儀設置的最后一個程序是擴增樣品溫育在4℃上，直到擴增樣品從PCR儀上取走。有些擴增樣品可以在PCR儀上過夜，以后貯存在-20℃中。
4. 抽取每種擴增樣品5～10μl，用瓊脂凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳來分析擴增結果，用DNA marker來判斷多增片段的大小。凝膠一般用EB（溴化乙錠）或SYBR金顆粒染色后來觀察擴增的量與片段大小。
一次成功的擴增反應應該產生與我們預期大小一致的DNA片段。擴增條帶可用DNA序列分析，Southern雜交和限制性內切核酸酶酶切圖譜予以鑒定。
如果以上這些鑒定都表明擴增產物是正確的，則從凝膠電泳的不同泳道可做進一步分析；從兩管陽性對照樣品的相應分子量的目的條帶的亮度與粗細可判斷PCR擴增的效率；陰性對照樣品在目的條帶附近應該沒有相應條帶的。從另一方面說，若以上這些鑒定都表明擴增產物不正確，分析結果參見表1與表2。
5. 若用礦物油覆在微量離心管內樣品液體的上層（步驟2），反應結束后可用150μl氯仿抽提去除。
在PCR反應管內，包含擴增DNA片段的水相與上層礦物油的界面形成彎月面，在彎月面下面的水相還有微膠粒。可用自動移液器小心吸取水相液體轉移到一個新的離心管內。為了許多目的（如用Centricon微量濃縮器純化擴增DNA樣品或者進一步克隆這種擴增產物）都必須把這種礦物油從樣品中去除。