聚合酶鏈式反應及其產物分析

實驗原理：PCR擴增是模擬天然DNA復制過程，利用DNA聚合酶在體外（試管中）擴增一對引物之間特異性DNA片段的方法。其主要熱循環過程可分為三個步驟：
　　 （1）高溫變性（denature）：提供DNA復制的有效模板。
　　 （2）低溫退火（anneal）：引物與模板DNA復性，提供游離3’-OH端供DNA復制起始；
　　 （3）中溫延伸（extend）：依賴Mg2+，DNA聚合酶催化合成與模板互補的新的DNA分子。
　　以上變性、退火、延伸三個過程組成一個循環周期；常循環25～40周期，經過n輪循環后，靶DNA的拷貝數理論上呈2n增長；循環進行完畢，通常zui后還在DNA聚合酶zui適溫度下延伸5～10分鐘。
操作步驟：本次實驗程序如下：
　　（1）標記一個潔凈的200uL反應管，向其中依次加入：
　　　　ddH2O 36 uL
　　　　10×PCR反應緩沖液 5uL
　　　　2mmol/L dNTPs 5uL
　　　　上游引物 1uL
　　　　下游引物 1uL
　　　　DNA模板 1uL
　　　　Taq DNA聚合酶 1 uL
　　　　總體積：50uL
　　 混合均勻后，蓋緊管蓋，離心5S，使反應成份均勻富集于管底。
　　（2） 加石蠟油50～100μl于反應液表面以防蒸發（此步驟根據PCR儀而定，如帶高溫熱蓋PCR儀不需加入）。
　　（3） 在PCR儀上設置反應循環參數，本次實驗為：94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，循環數為30，zui后于72℃充分延伸10 min后終止反應（16℃ 3 min）。
　　（4） 置反應管于PCR儀上進行熱循環。
　　（5） 反應完畢后，常取5～10％反應產物（如本次5uL）進行瓊脂糖凝膠電泳，通過溴乙錠染色，在紫外燈下觀察擴增產物的質量，正常DNA電泳帶應清晰、整齊，并通過與已知分子量大小的DNA標志物比較，初步了解產物大小是否與預期吻合。

注意事項：
　　 1. 戴手套操作，避免污染
　　　2．冰上操作