七、PCR檢測
PCR反應擴增出了高的拷貝數，下一步檢測就成了關鍵。熒光素（溴化乙錠，EB）染色凝膠電泳是最常用的檢測手段。電泳法檢測特異性是不太高的，因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因為其簡捷易行，成為了主流檢測方法。近年來以熒光探針為代表的檢測方法，有逐漸取代電泳法的趨勢。
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注意事項
1. 由于PCR反應靈敏度很高，因此要特別主意防止DNA污染的發生。樣品間的相互污染可能產生假陽性結果，特別是將PCR技術應用到臨床病原菌感染確定中。
2. 如果是公用的、沒有密碼保護的PCR儀，經常檢查PCR儀上的程序正確與否。
3. 不使用過量試劑“less is usually better (more specific)”。
4. 試劑購回后應分裝成小份使用，這樣一旦有污染發生，可以立即丟棄污染的試劑，不會造成大的損失；試劑分裝也有助于減少反復凍融次數（例如dNTPs對反復凍融敏感）。
5. 加完所有試劑后用槍頭吹打幾次或稍微渦旋或輕彈管壁以保證充分混勻。
6. 使用陰性對照檢查污染的發生。
7. 使用陽性對照（能良好擴增的樣本）。
8. 電泳時使用DNA分子量標準品（指示是否PCR失敗或條帶跑出凝膠或拍照系統失敗）。
9. 當擴增很長的、GC含量高的模板時或容易產生二級結構的模板時適量使用添加劑（glycerol, formamide, NMP使變性和退火溫度降低幾度；glycerol也可起到穩定聚合酶活性的作用；DMSO 減少二級結構的發生，并通過減弱非特異性引物結合的穩定性，提高反應的特異性）。
10. 不使用帶有自動除霜功能的冰箱存儲酶（避免反復凍融），每次取酶時都使用新的槍頭酶，酶使用后應立即放回冰箱。酶要在加完緩沖液后再加，直接將酶加入水中可能導致酶變性失活。
11. PCR產物的電泳檢測時間，一般為48 h以內，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規則甚致消失。
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其他
一、 PCR反應的關鍵環節
1. 模板核酸的制備。
2. 引物的質量與特異性。
3. 酶的質量。
4. PCR循環條件。
二、 PCR常見問題及對策
1. 假陰性，不出現擴增條帶
（1）模板原因
① 模板中含有雜蛋白質。
② 模板中含有Taq酶抑制劑。
③ 模板中蛋白質沒有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白。
④ 在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。
⑤ 模板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處 理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩定的消化處理液，其程序亦應固定不宜隨意更改。
（2）酶失活
① 需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導致假陰性。
② 忘加Taq酶或溴乙錠。
（3）引物
① 引物質量。
② 引物的濃度。
③ 兩條引物的濃度是否對稱。
解決對策：
① 選定一個好的引物合成單 位。
② 引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。
③ 引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。
④ 引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。
（4）Mg2+濃度
① 濃度過高降低PCR擴增的特異性。
② 濃度過低影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。
（5）反應體積的改變
① 通常進行PCR擴增采用的體積為20 ul、30 ul、50 ul或100 ul，應用多大體積進行PCR擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定;
② 在做小體積如20 ul 后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。
（6）物理原因
① 變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現假陰性。
② 退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率；退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。
③ 擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度有問題。
（7）靶序列變異
① 靶序列發生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合。
② 靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列。
2. 假陽性，出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。
（1）引物設計不合適
① 選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性。
② 靶序列太短或引物太短。
（2）靶序列或擴增產物的交叉污染
① 整個基因組或大片段的交叉污染。
解決方案：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。
② 空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產物，而導致假陽性的產生。
解決方案：可用巢式PCR方法來減輕或消除。
3. 出現非特異性擴增：PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。
（1） 引物與靶序列不完全互補或引物聚合形成二聚體。
（2） Mg2+離子濃度過高。
（3） 退火溫度過低。
（4） PCR循環次數 過多有關。
（5） 酶的質和量，往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶則不出現，酶量過多有時也會出現非特異性擴增。
其對策有：必要時重新設計引 物。減低酶量或調換另一來源的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環次 數。適當提高退火溫度或采用二溫度點法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）。
4. 出現片狀拖帶或涂抹帶
（1）原因
① 酶量過多。
② 酶的質量差。
③ dNTP濃度過高。
④ Mg2+濃度過高。
⑤ 退火溫度過低。
⑥ 循環次數過多引起。
（2）對策
① 減少酶量。
② 調換另一來源的酶。
③ 減少dNTP的濃度。
④ 適當降低Mg2+濃度。
⑤ 增加模板量。
⑥ 減少循環次數。