實驗概要
腸道微生物DNA是進行微生物分子生態學研究的前提。能否獲得高的DNA提取率和高質量的DNA，從而真實地反映微生物群落的實際情況，是保障研究結果是否可靠的關鍵。如何獲取高質量、較完整的腸道菌群基因組DNA是腸道微生物研究中的關鍵。本研究采用物理方法，化學方法，酶解法等進行DNA提取，并對其進行比較，經過優化得到最佳的提取方法，使其符合以后PCR擴增要求以及其它后續研究工作。試驗結果表明用液氮研磨加CTAB提取液的方法提取的腸道微生物總DNA的效果高于其它方法。并且通過電泳以及PCR檢測，所提取的DNA的質量適于進一步的分子生物學研究。
實驗材料
健康成年對蝦購于市場，挑取生長較好、大小均一的，于超凈臺下取腸道，無菌操作。
實驗步驟
1. DNA提取方法
方法A：
1) 取0.02g蝦腸加入總量1mL PBS勻漿，液氮研磨
2) 加入250uL 0.5% Tween-80，吹打洗脫3min
3) 300g離心5min，取上清
4) 10000g離心l0min，棄上清
5) 加入250uL DNA裂解液，渦旋混和器上混合30s
6) 65℃水浴20min，期間每5min混合一次
7) 12000g離心15min，取上清
8) 加等體積酚/氯仿，14000g離心15min，取上清
9) 加入2.5倍體積異丙醇，-20℃靜置1-2h
10) 4℃ 14000g離心15min，棄上清
11) 加入300uL 70%預冷乙醇，14000g離心l0min，棄上清
12) 超凈臺下干燥，加50uL TE重懸，凍于-80℃
方法B：
1) 取0.02g蝦腸，加130uL CTAB提取液，冰浴超聲100W，5min
2) 放入液氮中冰凍20min，迅速放入65℃水浴中5min，重復3次
3) 放入37℃搖床，加10uL溶菌酶，振蕩30min
4) 加15uL 20%(W/C)SDS } 65℃溫育2h
5) 4℃ 3200g離心l0min，取上清
6) 加100uL CTAB液和25uL 20 %SDS，渦旋，65℃溫育l0min
7) 3200g離心，取上清
8) 加等體積酚/氯仿，14000g離心15min，取上清
9) 加0.7倍體積異丙醇，-20℃靜置1-2h
10) 4℃ 14000g離心15min，棄上清
11) 加入300uL 70%預冷乙醇，14000g離心l0min，棄上清
12) 超凈臺下干燥，加50uL TE重懸，凍于-80℃
方法C：
1) 取0.02g蝦腸，液氮研磨，加入總量1mL PBS和20uL 20% PVPP勻漿
2) 200g離心6min，取上清，沉淀中加1mL PBS離心取上清，合并上清；300g離心6min，取上清
3) 1200g離心6min，收集菌體，并用PBS洗滌
4) 得到的菌體中加入300uL裂解液I，10%溶菌酶100uL，1% RNase 20uL，混勻后37℃保溫30min
5) 加入300uL裂解液II，50uL 20% SDS，50uL 20% PVPP，混勻冰浴5min
6) 加等體積酚/氯仿，13000g離心8min，取上清，重復1次
7) 加入2倍體積異丙醇和1/10倍體積3M醋酸鈉，-20℃沉淀2h
8) 4℃ 14000g離心15min，棄上清
9) 加入600uL 70%預冷乙醇，14000g離心10min，棄上清
10) 超凈臺下干燥，加50uL TE重懸，凍于-80℃
優化CTAB法：
1) 無菌條件下剖取對蝦腸道，放入無水乙醇中，凍于-80℃
2) 取蝦腸(0.02g左右)，液氮研磨，加入總量1mL PBS和20uL 20% PVPP，0.5% Tween-80，吹打洗脫3min
3) 200g離心6min，取上清，沉淀中加1mL PBS離心取上清，合并上清；取上清
4) 1200g離心6min，收集菌體，并用PBS洗滌
5) 得到的菌體中加130uL CTAB提取液和10uL溶菌酶，放入37℃搖床，
6) 加15uL 20%(W/C) SDS和10uL蛋白酶K，65℃水浴2h
7) 4℃ 3200g離心10min，取上清勻漿；加入250uL300g離心6min，振蕩30min
8) 加100uL CTAB液和25uL 20% SDS，渦旋，65℃水浴l0min
9) 3200g離心，取上清
10) 加等體積酚/氯仿，14000g離心15min，取上清
11) 加0.7倍體積異丙醇，-20℃靜置1h
12) 4℃ 14000g離心15min，棄上清
13) 加入600uL 70%預冷乙醇，14000g離心l0min，棄上清
14) 超凈臺下干燥，加50uL TE重懸，凍于-80℃備用
2. DNA濃度測定和電泳檢測
所提DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。用紫外分光光度計于260nm，280nm波長下測定粗提DNA的吸光值及濃度，計算出A260/A280值。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
3. 腸道微生物DNA的PCR檢測
PCR引物為接近全長的細菌通用引物:27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTC-3'； M=A或C)；13878 (5'-GGGCGGWGTGTACAAGGC-3'；W=A或T)。
將提取到的基因組DNA稀釋20倍后分別取1，2，4，8uL和原樣1uL，2uL作為模板。PCR反應體系是：無菌雙蒸水34.5ul，10XPCR緩沖液5ul，2.5 mmol/L dNTP 4ul，2.5 umol/L PCR引物各2ul，Taq酶0.5ul。反應條件:94℃預變性4 min； 94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 2 min，30個循環；72℃ 10 min。
取5uL PCR擴增產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，DNA Marker選用DL2000，紫外檢測擴增產物，凝膠成像。