| 實驗步驟 | 許多凝膠染色方法適用于后續的 MALDI-TOF 肽質量指紋圖譜（PMF ) 分析。在第 14 章已經比較討論了一些染色方法的性能和兼容性。
3.1 膠內消化
凝膠消化方法改編自 Jensen 等。
對于凝膠處理和消化步驟，必須認真處理樣品，盡量減少外源性角蛋白的污染（如頭發、皮膚、羊毛衣服、氣流、通風冷卻等）（見注釋 1)。
1. 從二維聚丙烯酰胺凝膠挖蛋白質點
( 1 ) 將 1 ml 槍頭在離尖端 5 mm 處用刀片切除，做一個打孔器（切口直徑 1~2 mm ) ( 見注釋 2) 。
( 2 ) 挖取凝膠點，并轉移到離心管中。
2. 清洗凝膠碎片
( 1 ) 用 100 μl 碳酸氫銨緩沖液清洗（振蕩 15 min) ，然后棄上清液。
( 2 ) 用 100 μl 乙腈/碳酸氫銨緩沖液洗兩次（振蕩 15 min) ，然后棄上清液。
( 3 ) 用 100 μl HPLC 級乙腈清洗（振蕩 15 min) 使凝膠碎片收縮，然后棄上清液。
( 4 ) 離心式蒸發器上真空干燥凝膠碎片。
經上述洗滌后，凝膠片段在 -20°C 可以貯存幾個星期，可再用于凝膠消化。
對于二維凝膠，在凝膠消化之前沒有必要進行半胱氨酸殘基的還原和烷基化（見注釋 3)。
3. 膠內消化（見注釋 4 和注釋 5)
( 1 ) 將凝膠碎片置于冰上（見注釋 6)，加入 8 μl 冷卻的消化緩沖液。
( 2 ) 20 min 后，用少量碳酸氫銨緩沖液調整以覆蓋凝膠。
( 3 ) 37°C 溫育 4 h ( 或過夜，見注釋 7) 。
4. 多肽片段的提取、濃縮、脫鹽
1 ) 多肽片段的提取
( 1 ) 加入 20 μl TFA 溶液（超聲 15 min) ，提取胰蛋白酶消化產生的多肽片段。上清液保存在 500 μl 離心管中。
( 2 ) 用 20 μl 的 3 : 2 乙腈/TFA 液提取（超聲 15 min) 。收集上清液。
2 ) 肽濃縮和脫鹽
( 1 ) 通過真空離心機將上清液濃縮到大約 10 μl 的體積。這一步去除乙腈（否則多肽片段將不能固定在疏水色譜介質），并減少體積量至合適的范圍以便能進行下一步的色譜操作。
( 2 ) 牢牢固定 ZipTip 在 10 μl 的可調移液管上（背壓可能很高）。
( 3 ) 用 10 μl 的 3 : 2 乙腈/TFA 溶液清洗 ZipTip 5 次。去除清洗液。
( 4 ) 用 10 μl 的 TFA 溶液平衡 ZipTip 5 次 。去除清洗液。
( 5 ) 不用抬高吸管尖頭，慢慢吸出和分散 10 μl 濃縮上清液 10 次，固定住肽片段。
( 6 ) 用 10 μl TFA 溶液清洗固定的肽（脫鹽）4 次。去除清洗液。
( 7 ) 用 2 μl 的 1:1 乙腈/TFA 溶液洗脫多肽片段至 500 μl 微量離心管中。
3.2 MALDI-TOF 肽質量指紋圖譜
( 1 ) 在 MALDI 過程中，樣品通常是與芳香有機物共結晶出來。這些有機物通常是酸性化合物（基質），主要性質是吸收紫外激發波長（一般為氮激光的 337 nm 波長或三倍頻率的 Nd: YAG 激光的 355 nm 波長）。在解吸過程中，當紫外激光發射時，基質的芳香基團（大量存在，超過 10000 : 1 ) 吸收紫外能量，導致基質升華為氣態，不致于使樣品分解或解離。
( 2 ) 電離過程是發生在帶電的基質離子和中性的肽片段之間（離子-分子反應）的高濃度、不停擴張和冷卻的氣相質子交換過程。
( 3 ) —旦解吸和電離，TOF 管中的樣品加速沖向探測器，它的速度（在固定長度飛行管的 TOF) 與 m/z 的均方根成正比。
( 4 ) 該反射鏡（靜電鏡）修正初始動能分布，因而能提高質量分辨率和質量準確度 ( 具有較大動能的等壓離子在反射鏡中有更大的路徑，在探測器聚焦平面以較低的動能 )。
( 5 ) 延遲或脈沖離子的萃取會糾正初始空間分布，因而再次提高分辨率和質量準確度（根據離子從源頭到分析儀提取開始時的位置，解吸室的等壓離子將會加速空間分布)。
現在有許多涉及 MALDI-TOF 和 MS 基本知識的專業文獻或書，也可參閱它們。
MALDI-TOF 質譜技術是 PMF 的首選，主要是因為 MALDI-TOF 具有一些優勢特點。
( 1 ) 軟電離技術（在 MALDI 過程中肽片段能保持完整)。
( 2 ) 電離方法也適合不同多肽混合物的分析，該方法較耐污染（緩沖液、鹽、增塑劑等) 。
( 3 ) 方法靈敏度高（有 MALDI 過程和 TOF 質量分析儀) 。
( 4 ) 良好的分辨率，目前已經超過 15000 [ 全寬，半質量（FWHM )] ，在感興趣的質量范圍可檢測單一同位素峰。
( 5 ) TOF 分析儀具有很高的質量精度（通常為 10~30 ppm) 。
( 6 ) 能快速得到實驗數據。
1. 目標樣本沉積
1 ) 經典干燥液滴法
( 1 ) 半飽和氰基-4-羥基肉桂酸（約 5 mg/ml) 的配制：將 α-氰基-4-羥基苯甲酸溶解在 300 μl 1 : 1 乙腈/ TFA 溶 液（超聲 10 min) 。離心幾秒鐘得到上清液。取 200 μl 上清液加到微量離心管中，并加入相同體積（200 μl ) 的 1 : 1 乙腈/TFA 溶液，就能配制成獲得半飽和的 α-氰基-4-羥基肉桂酸。
( 2 ) 取 0.8 μl 消化溶液和 0.8 μl 基質加到微量離心管中，快速混合（避免在吸管尖結晶）。取 0.8 μl 混合液滴到 MALDI 標基上，其余的 0.8 μl 混合液可滴在 MALDI 標基的另一個位置。吸管尖頭不要接觸到標基。
( 3 ) 讓混合液自然干燥并結晶出來（見注釋 8) 。
2 ) 在疏水標基上干燥液滴法（見注釋 9)
( 1 ) 準備 α-氰基-4-羥基肉桂酸：稱取 10 mg 的 α-氰基-4-羥基肉桂酸，溶解在 1 ml 的 1:1 乙腈/TFA 溶液中（超聲 10 min) 。取 56 μl 上述溶液放入一新的微量離心管中，并添加 994 μl 的 1 : 1 乙腈/ TFA 溶液。
( 2 ) 將 0.8 μl 凝膠消化后的上清液（見 19.3.1 節 3 ) 和 0.8 μl 上述溶液快速混合。
取 0.8 μl 混合液滴到 MALDI 標基上，其余的 0.8 μl 混合液可滴在 MALDI 標基的另一個位置 [ 見 19.3.2 節 1.1)]。
( 3 ) 讓混合液自然干燥并結晶。
( 4 ) 滴加 4 μl TFA 溶液到晶體上，接觸 30s 后，用吸管吸走液體（吸管尖不要接觸晶體) 。
( 5 ) 加入 0.8 μl 的乙醇/丙酮/TFA 溶液，再次結晶。
( 6 ) 讓混合液自然干燥并結晶出來。
2. 光譜采集
( 1 ) 將標基插入質譜儀中，并在真空中（低于 10-6 Torr) 穩定。
( 2 ) 打開髙壓 [ 最好等待 20 min 讓電壓和溫度恒定（焦耳效應 ) ]。
( 3 ) 調整激光功率（衰減）和標基位置，以便在 700~4000 Th 能得到好的信噪比和單一同位素分辨率。
( 4 ) 先激光發射 10 次，但所得圖譜沒有多大價值，因為它們通常是小質量分子( 基質和/或鹽）的嘈雜圖。
( 5 ) 激光發射 80~200 次，獲取圖譜并進行疊加。
( 6 ) 在 842.5099 Th 和 2211.1046 Th 處用水解胰蛋白酶得到離子進行質譜內部校正。
( 7 ) 保存圖譜（見注釋 10)。
3. 圖譜解析
對單一同位素質量可以進行自動指認，但我們建議應仔細檢查這些解析（見注釋 11 和注釋 12)。
如果沒有對圖譜進行平滑處理，可以對所有的初次單一同位素肽段峰進行解析，除了已知的胰蛋白酶產生的峰（ 圖 19-1，見注釋 13 和注釋 14 的細節描述）。
3.3 MASCOT 數據庫檢索使用并搜索結果的評價
下面描述的步驟是針對 MASCOT PMF 搜索引擎（Matrix Science，London, UK ) 內部授權（見注釋 15 ) 或使用遠在倫敦的服務器（http://www.matrixscience.com/cgi/search_ form, pi? SEARCH = PMF)。
當然，所述的搜索策略也可直接適用于其他搜索引擎（見注釋 16)。
1. 搜索的第一步驟
這個步驟（圖 19-2 的左邊）的目的是為了獲得數據質量的總貌，以消除可能的污染物，并有可能直接確認植物蛋白質。
( 1 ) 確定一個全球開放的數據庫（如 MSDB，NCBInr 或 SWISS- PROT) ，而不是特定物種之一，數據庫包含有非植物的蛋白質污染物。
( 2 ) 不要在分類學領域（即 “ 所有項目” ）指定品種，以確定非植物的蛋白質污染物。
( 3 ) 允許錯過一個缺口。
( 4 ) 設置一個大的質量承受值為 100 ppm，以評估質譜校準（用于質譜校準的兩個胰蛋白酶水解的肽段，它們的豐度和離子統計學意義可能很低，不能進行很好校準）。
( 5 ) 固定化修飾：羧甲基（C) 或脲甲基（C ) 。用碘乙酸或碘乙酰胺還原和烷基化凝膠樣品的蛋白半胱氨酸殘基，會分別產生羧甲基半胱氨酸或酰胺甲基半胱氨酸（包括在脲甲基半胱氨酸中）。
( 6 ) 變量的修改：無。
如果數據結果好（信噪比好，質量準確度高，污染物少）以及數據庫中能搜索到參考的蛋白質，則可以得到希望的蛋白質信息（圖 19-2B ) 。
候選蛋白質的評價標準有下面幾條：
( 1 ) 分數優于重要臨界值。
( 2 ) 最優蛋白質與非相關的蛋白質之間差別較大。
( 3 ) 所研究物種（或同源性很高的相近物種）的蛋白質為最優蛋白質第一級。
( 4 ) 候選蛋白質的分子質量和等電點與二維凝膠數據兼容。
( 5 ) 良好的質量準確度（最好）或不好的質量準確度（由于校準失敗或錯誤校準問題 ) ，但在質量范圍內，與質量分散具有低的和線性分布的關聯。
( 6 ) —個裂解的肽段對三個匹配肽段的最大化。
( 7 ) 5 個匹配肽段的最小化。
( 8 ) 在蛋白質序列和序列覆蓋中匹配肽段同質定位（見注釋 17 和圖 19-2C) 。
2. 第二步和后續搜索步驟
如果搜索沒有得到結果，或者如果太多的峰（如超過 10 個）沒有匹配（可能表明挖的點包含兩個或更多的蛋白）（見注釋 18 和圖 19-2 的右邊圖），就需要進行進一步的搜索。
可選擇更多的搜索條件（圖 19-2D)：
( 1 ) 刪除確定非植物蛋白肽的消化污染物峰（“搜索無與倫比” 的吉祥物選項按鈕 )。
( 2 ) 設置質量公差根據實際觀察到的質譜的質量準確度（如作為評估非植物蛋白質污染物或核實有關胰蛋白質酶自動酶解片段）。通常情況下，優質的搜索要求質量準確度低于 30 ppm ( 較低值更好）。
( 3 ) 允許用非化學計量或不可預測的化學修飾搜索（主要是蛋氨酸氧化，天冬氨酸和谷氨酸甲基酯酰化，N 端焦谷氨酰甲基化（pyroglutamylation) ( 見注釋 19) 。
( 4 ) 限制類群的搜索范圍（如 Viridiplantae 蛋白質數據庫）。
( 5 ) 允許在一個特定的數據庫搜索。
在小節 3.3.1 中提及說明的評價和確認標準仍然很有必要（圖 3-2E 和 F ) 。同時，鑒定混合物中次級組分也很重要。
通過肽質量指紋圖譜（PMF ) 成功鑒定一個蛋白質后，在 MALDI-TOF 質譜中往往還有好幾個離子峰不能鑒定出來。這些未鑒定出來的峰可能有不同的來源：
( 1 ) 在電泳凝膠中共同遷移的其他蛋白質的肽段離子峰。
( 2 ) 同一蛋白質的肽段離子峰，但是它的氨基酸序列和搜索數據庫中的蛋白質序列有微小的差異（可能是基因組注釋錯誤或突變引起的）。
( 3 ) 同一蛋白質的肽段離子峰，但是由于翻譯后修飾的緣故，它的分子質量與預測的肽段質量不一致。
( 4 ) 因蛋白質污染出現的肽段離子峰（如角蛋白或胰蛋白）。
( 5 ) 因多聚體殘渣或塑化劑污染出現的非肽段離子峰。
( 6 ) 因生物化學試劑藥品污染出現的非肽段離子峰。
3.4 MALDI-TOF/TOF 策略
通過 PMF 鑒定的蛋白質只是作為初步的候選，鑒定蛋白質的得分情況表明可信程度。因此，我們應該進一步對 PMF 所得的離子峰進行二級測序，來提高并確認鑒定蛋白質的可信性。
在最近的 TOF/TOF 串聯質譜分析儀未發明之前，在 MALDI 質譜分析儀上對肽段進行測序的成功率并不高。在 TOF/TOF 分析儀上，一級 TOF 能分離得到我們所需的肽段離子，其他肽段離子直接去掉，通過一級 TOF 的轟擊篩選后，剩余的肽段都是特異的氨基酸序列肽段。然后二級 TOF 分離并測量這些特異氨基酸序列片段的分子質量。
1. 鑒定確認
為了確認鑒定的可信性，從單個蛋白質中鑒定的 1~3 個肽段通過 TOF/TOF 進行連續轟擊。得到的片段離子必須和預測肽段序列相匹配。
2. 未知蛋白質的鑒定
在通過蛋白質數據庫鑒定結果不理想的情況下（ 見 3. 3) ，有些肽段（通常情況是 2~5 個）能通過 TOF/TOF 進行分析。從頭開始測序結合蛋白質數據庫搜索這些肽段離子的 TOF/TOF 離子片段，可能能成功鑒定這些未知蛋白質。搜索鑒定所選數據庫應為研究對象所屬分類或是種間交叉相關性的物種的蛋白質數據庫（見第 20 章中LCMS/MS 部分)。 展 |
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