用肽質量數據鑒定蛋白質所控制的實驗參數中，最具決定性的參數是肽質量測量的精確度 。質量精確度越高，結果判定越可信。另一決定性參數是所用酶（或化學試劑）的專一性。酶越純，專一性胞高，檢索結果可信。常用的酶是胰蛋內酶。但是要注意的是，即便是高純度的胰蛋白酶也會在非 Lys, 或 Arg 的氨基酸殘基 C 端酶切（其后不是 Pro) 。所有蛋白酶都存在的問題是，如果蛋白序列中有 2個或更多個連續氨基酸殘基是酶的切點，蛋白酶會對底物酶切小完全，留下漏切的位點和不完全的未端，許多檢索程序把酶切的位點數目作為輸入的一個檢索參數。內切酶 LysC 是另一個具高度專一性的酶，此酶產生的自切產物比胰蛋白酶少，但同樣也會有漏切位點，也會在非 Lys位點酶切（其后不是 Pro), 同樣也要注意，不是所有的蛋白質，不論是否經凝膠分離，都適用于胰蛋白酶或其他專一性蛋白酶切，但是，凝膠分離的蛋白質。由于其處丁變性狀態，通常酶切十分有效。
蛋白酶的性能很難改變，與之不同的是肽質量測定精確度依賴于所使用的儀器及其操作 最佳的肽質量檢索應該用內標校正的單同位素質量。在 MALDI-MS 質譜儀中，通常，只有安裝時間延遲聚焦／延遲提取（見前文）的儀器，能夠站到肽質量的同位素分布分辨率。這種儀器達到 5ppm 的質量準確度，可確定單同位素質量，并在肽質量檢索程中設立非常小的質量誤控，這樣高精度的數據減少了錯誤匹配的可能性。如來沒有安裝延遲提取選件，質譜儀應該用內標校正，且內標質量范圍內包含被檢測肽段的質量。沒有延遲提取裝過的儀器不能分辨同位素峰，僅得到平均分子質量。單同位素質量比平均分子質最更精確，因為單同位素質量是由單一同位素 C12 決定的，而平均質量是由 C12 和本同數目的間位素 C13 質量的平均值決定的（其他元素的同位素相似）。為了進一步增加肽質量的信度，開發正交法，對單個肽段的氨基酸序列或組成提供額外的，或限制性的信息。這種方法中，樣品除用于原始質量測量外，還分出一部分用于正交分析。正交分析信息限制了用肽質性在數據庫中檢索鑒定蛋白質產生的多個肽段與同一質量匹配的情況。正交方法可分為以下幾類 ：
(I) 特異位點的化學修飾。 甲酯化，在每個羧基集團上增加 14個質量單位［如酸性氨基酸殘基（Asp, Glu) 側鏈或肽的 C 末端; 碘化反應，在酪氨酸上增加 126個質量單位; 及用 1:1 混合的乙酰氨/氚代乙酰氨在每個半胱氨殘基上進行同位素標記。
(2) 測定肽段的部分氨基酸組成。有兩種方法 如果肽段中的可交換氫在氘溶液中被交換，那么每一個氨基酸有其特定的交換數目，每個殘基為 0 至 5個質量單位。因此，肽質量增加的總數就反映了肽的氨基酸組成,肽段部分氨基酸組成也可通過鑒別 MS/MS 質譜圖中的氨離子 (immooium ion)峰來確定。
(3) 鑒定 N 末端氨基酸殘基。 混合物中肽段的 N 末端氨基酸確定可用化學法，一步 Edman 反應或酶法，用氨肽酶除去末端氨基酸殘基。
(4) 肽內不同酶切位點的鑒定 為了確定短肽中一個特定殘基的存在及相對位點，有人采用酶切位點不同的酶對一級水解產物進行二次水解（次級水解）。同樣也可把一份樣品分為兩等分用切點不同的酶平行水解
(5) 鑒定 C 末端殘基 與 N 末端殘基鑒定相似，用羧肽酶除去 C 未端氨基酸殘基，某些情況下，會有一個或多個額外的殘基被水解。但是當使用高度右~ 性的尚時，除去一個殘基不能提供太多信息。 展開 | 