| 實驗材料 | |
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| 試劑、試劑盒 | Taq 聚合酶10×緩沖液引物dATPdGTPdCTPdTTPMgCl2MnCl2完全極限（CM） 缺失成分培養基和平板Xgal 平板 |
| 儀器、耗材 | |
| 實驗步驟 | 實驗所需「材料」、「試劑」、「耗材」具體見「其他」 1. 制備 PCR 預混合物（共 3.775 ml）： 500 ul 10×Taq 聚合酶緩沖液 5 ul 1 mol/L MgCl2 10 ul 100 mmol/L dATP 10 ul 100 mmol/L dGTP 50 ul 100 mmol/L dCTP 50 ul 100 mmol/L dTTP 125 ul 20 umol/L 引物 1 125 ul 20 umol/L 引物 2 2.9 ml 水 2. 對每一個樣品，加入下列試劑到 PCR 管中： 12 ul 水 1 ul 肽適配體表達載體 10 ul Mg2+/Mn2+ 溶液 76 ul PCR 預混合物 1 ul Taq 聚合酶（5 U） 3. 用下列 PCR 反應程序進行擴增反應： 4 個循環： 30 s 95℃ （變性） 1 min 55℃ （復性） 1 min 72℃ （延伸） 4. 移出 13 ul 反應混合液到一新的 PCR 管中，新管中預先吸入： 10 ul Mg2＋/Mn2＋溶液 76 ul PCR 預混合物 1 ul Taq 聚合酶 用同樣的 PCR 程序擴增。 5. 重復總共 10 輪的擴增。 6. 用 PCR 純化柱或瓊脂糖凝膠電泳純化 PCR 產物。 7. 用 Ava II 消化純化的 PCR 產物，然后按照標準的亞克隆技術將其亞克隆到經 II 酶切過的 PJM-I1中。 8. 用乙酸鋰酵母轉化法將 pBait 和 pBR1840 轉入 EGY48 中。在 10 cm Glu/CM-His、-Ura 平板上篩選轉化株。 9. 用高效乙酸鋰方法將 10～50 ug 突變的肽適配體庫轉化含 pBait 和 pBR1840 的 EGY48。在 10 cm Glu/CM-His、-Ura、-Trp 平板上篩選轉化株。 10. 收集轉化株，測定平板效率。 11. 接種約 5 個庫等價物到 1 ml Gal/Raf/CM-His、 -Ura、-Trp 液體培養基中。于 30℃ 振蕩培養 4 h。 12. 室溫下，于 3000 g 離心 4 min。棄上清，將酵母沉淀重懸于 1 ml 無菌水中。 13. 將酵母涂布到 15 cm Gal/Raf/CM-His、-Ura、-Trp， X-gal 平板上，于 30℃ 培養至克隆出現（約 2 天）。 14. 將藍色克隆劃線接種到一 10 cm Glu/CM-His、-Ura、-Trp 主平板上并于 30℃ 培養 1 天。 15. 將主平板復印到 10 cm Gal/Raf/CM-His、-Ura、-Trp、X-gal 平板和 Glu/ CM-His、 -Ura、-Trp、X-gal 平板上。 16. 從依賴半乳糖的藍色克隆中回收質粒并重新導入，含有 pBait 和 pBR1840 的酵母株 EGY48 中以再次驗證表型。 17. 從依賴半乳糖的藍色克隆中回收質粒并對可變區進行測序。 |
| 注意事項 | |
| 其他 | 1. 材料 質粒 DNA：肽適配體質粒，pBait，pJM-1， pRB1840（1-LexAop-LacZ 報道質粒）和 pJK103 酵母株：EGY48 Mata ura3 trpl his3 3LexA-operator-leu2 2. 試劑 5 U/ul Taq 聚合酶和 10×緩沖液（Life Technologies） 1 mol/L MgCl2 100 mmol/L dATP 100 mmol/L dGTP 100 mmol/L dCTP 100 mmol/L dTTP 20 umol/L 引物 1： 5'-CCGCCGCCTGAATTCATGAGCGATAAAATTATTCAC-3' 20 umol/L 引物 2： 5'-CGGGGCGATCATTTTGCACGGACC-3' Mg2+/Mn2+ 溶液：45 mmol/L ，MgCl2 和 5 mmol/L MnCl2 PCR 純化柱（可選；如 Qiagen） 完全極限（CM） 缺失成分培養基和平板，補加 2％ （m/V） 葡萄糖 （Glu） 或 2％ （m/V） 半乳糖和 1％ im/V） 棉籽糖 （Gal/Raf）： Glu/CM-His、-Ura （10 cm 平板） Glu/CM-His、-Ura、-Trp （10 cm 平板） Gal/Raf/CM-His、-Ura、-Trp （液體培養基） Xgal 平板 Glu/CM-His， -Ura， -Trp， X-gal （10 cm 平板） Gal/Raf/CM-His， -Ura， -Trp， X-gal （10 cm 和 15 cm 平板） 3. 耗材 PCR 管 自動熱循環器 30℃ 培養箱 |