7、實驗所需器材（但試劑盒不提供）
1） 移液器（10；10-100；100-1000μL）
2） 軌道搖床（200-900rpm）
3） 旋渦混合器
4） 帶儲器的8通道移液器
5） 洗滌瓶，自動或半自動包被板清洗系統
6） 酶標儀
7） 雙蒸水或去離子水
8） 吸水紙，取樣吸頭，計時器
8、實驗前說明
注意 | 用于96人份檢測色試劑盒成分可分成兩次進行。，下列所述體積為做48人份時所需要的量。 |
8.1樣品的稀釋
如果樣品中腎上腺素濃度高于最高標準品的應按照下列所述進行稀釋：
樣品 | 待稀釋 | 稀釋液 | 備注 |
血漿 | 腎上腺素濃度高于最高標準品中腎上腺素的濃度 | 雙蒸水 | 提取步驟前 |
尿液 | 腎上腺素濃度高于最高標準品中腎上腺素的濃度 | 0.1N的HCl | 提取步驟前 |
8.2樣品、標準品和質控品的提取（提取板）
1） | 將標準品、已稀釋好的質控品、已稀釋好的尿液樣品各20μL和500μL血漿樣品加入到提取板相應的微孔中。除血漿樣品孔外，在所有的微孔中加入500μL雙蒸水以消除體積差別。 |
2） | 在每一微孔中加入1000μL提取緩沖液 |
3） | 蓋板。在軌道搖床（600-900rpm）上18-25℃的環境下提取30min。在提取過程中，液體的表面應該會浸濕粘性金屬板，但液體的量不能超過微孔的2/3。液體是否濺出并不會影響實驗結果。 |
4） | 移去粘性金屬板，快速棄取孔內反應液，在吸水紙上拍干。 |
5） | 每孔加入2ml雙蒸水 |
6） | 用新的粘性金屬板蓋板。在軌道搖床上（600-900rpm）18-25℃的環境下振蕩5min。液體是否濺出并不會影響實驗結果。 |
7） | 移去粘性金屬板，快速棄取孔內反應液，在吸水紙上拍干。 |
8） | 每孔加入150μL提取緩沖液，再向每孔中加入50μL酰化試劑，立即混合均勻。 |
9） | 在軌道搖床（400-600rpm）上18-25℃的環境下提取20min。（無需蓋板） |
10） | 快速棄取孔內反應液，在吸水紙上拍干。 |
11） | 每孔加入2ml雙蒸水。 |
12） | 用新的粘性金屬板蓋板。在軌道搖床上（600-900rpm）18-25℃的環境下振蕩5min。液體是否濺出并不會影響實驗結果。 |
13） | 移去粘性金屬板，快速棄取孔內反應液，在吸水紙上拍干。 |
14） | 每孔加入300μL Release緩沖液。 |
15） | 在軌道搖床（400-500rpm）上18-25℃的環境下振蕩30min。（無需蓋板） |
已準備好的樣品應當在當天就進行檢測。如果不行的話，您可將提取板用粘性金屬板蓋好，在2-8℃的環境下可存放一夜。
9、實驗步驟
9.1 COMT酶溶液的準備
注意：COMT酶溶液應在使用前直接臨時配置。 |
在COMT凍干粉中加入1.25ml雙蒸水，充分混和。再加入1.25ml酶聯溶液，然后再加入1.25ml酶溶液和0.40ml COMT添加劑以充分混合溶解的COMT試劑*，COMT酶溶液最后的體積為每支4.15ml。一支可做48人份。溶液可用旋渦混合器混合，但要避免氣泡產生，配置好的COMT溶液可在室溫下穩定存放1小時。 |
*如果只需要一定量的COMT溶液，則剩余的COMT溶液應立即凍存于-20℃的環境下。COMT溶液可在此環境下穩定存放1-2個月。
9.2樣品、標準品和質控品的酶分化
注意 | 如果要檢測腎上腺素和去甲腎上腺素，我們建議您先檢測腎上腺素。如果使用自動置換型衣液器加樣，請將取樣吸頭內的殘余液體加入到提取板的相應微孔內，否則剩余的提取液不夠去甲腎上腺素檢測用。將提取板放到有一定坡度的位置上。實驗開始前，確定好腎上腺素和去甲腎上腺素的檢測孔并標記好。 |
9.3尿液與血漿中的甲腎上腺素
1 | 在每一微孔內加入25ul臨時配制的COMT酶溶液，輕輕振板以使溶液混合均勻。 |
2 | 將提取好的標準品、質控品和樣品分別25ul加入到相應的微孔內。在此步驟中，我們可以將取樣吸頭直接深入到COMT溶液里。加樣后，溶液顏色變成粉色，輕輕振板以使溶液混合均勻。 |
3 | 向每一微孔中加入50ul甲腎上腺素抗血清（綠色）。 |
4 | 蓋板，在軌道搖床上（400-600rpm）18-25℃的環境下孵育120min。 |
8.4凍干粉或濃縮成分的準備
稀釋 | 成分 | 稀釋液 | 比例 | 備注 | 貯存 | 穩定性 | |
20ml | 洗滌液 | 180ml | 雙蒸水 | 1：10 | 充分混合 | 2-8℃ | 4W |
60μL | 酶聯物 | 6ml | 洗滌緩沖液（已稀釋好） | 1：101 | 臨時配置，僅能使用一次，混合時避免氣泡產生 | 18-25℃ | 30min |
4 | PNPP底物片 | 10.7ml | PNPP底物緩沖液 | 臨時配置，僅能使用一次 | 18-25℃ | 10min |
9.5 ELISA實驗步驟
1） 移去粘性金屬板，棄取孔內反應液，每孔用250-300ul稀釋好的洗滌液洗板4次。最后在吸水紙上拍干以除去殘余液體。
2） 在每一微孔中加入100ul臨時配置好的酶聯物。
3） 蓋板，在軌道搖床上（400-600rpm）18-25℃的環境下孵育60min。
4） 移去粘性金屬板，棄取孔內反應液，每孔用250-300ul稀釋好的洗滌液洗板4次。最后在吸水紙上拍干一除去殘余液體。
5） 如果可以的話，使用8道移液器加底物液和終止液。加底物液和終止液的時間間隔應當相同，使用自動置換型移液器并避免氣泡產生。
6） 在每一微孔中加入200ul底物液。
7） 不要蓋板，在軌道搖床上（400-600rpm）18-25℃的環境下孵育60min。
8） 在每一微孔內加入50ulPNPP終止液以終止酶反應。輕輕振板以使溶液混合均勻。
9） 加終止液后60min內405nm處讀取OD值。
10、期望值
實驗結果不能當作判斷任何治療結果的唯一因素，疾病的判斷還應當與其它臨床觀察和診斷檢測相結合。以下結果為正常人群的正常值（5%-95%），建議每個實驗室讀確定自己的正常值范圍：
尿液 | 血漿 | |||
μg/d | nmol/d | pg/mL | nmol/L | |
去甲腎上腺素 | ＜20 | ＜110 | ＜125 | ＜0.68 |
本譯文僅供參考，詳情請以原文為準。